陳瓊 甘祥武 黃魁英 趙樂怡 李學(xué)優(yōu) 鮑志寧

摘要[目的]在篩選到一株食品源植物乳桿菌LPL10的基礎(chǔ)上，通過對(duì)其耐酸性、耐膽鹽、抑菌能力和產(chǎn)酸能力進(jìn)行研究，確定其益生特性。[方法]采用平板活菌計(jì)數(shù)法測(cè)定LPL10的耐酸、耐膽鹽性能，通過抑菌圈法評(píng)價(jià)菌株的抑菌能力，高效液相色譜法測(cè)定LPL10發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸能力。[結(jié)果]植物乳桿菌LPL10具有良好的低酸耐受能力，在pH 3.5條件下培養(yǎng)24 h活菌數(shù)為1.2×108 cfu/mL，存活率為148%;LPL10受0.1%膽鹽抑制影響較小，培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)為3.60×108 cfu/mL，存活率為356%;植物乳桿菌LPL10對(duì)指示菌金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和綠膿桿菌均有良好的抑制作用;LPL10發(fā)酵上清液中產(chǎn)的主要有機(jī)酸為乳酸和乙酸，相對(duì)含量分別為20.33、25.26 mg/L。[結(jié)論]體外益生特性研究表明，植物乳桿菌LPL10可以作為潛在的益生性菌株。

關(guān)鍵詞植物乳桿菌;耐酸;耐膽鹽;抑菌;產(chǎn)酸能力

中圖分類號(hào)TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）02-0156-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.047

乳酸菌是發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類革蘭氏陽性、無芽孢、厭氧生長(zhǎng)細(xì)菌的總稱，它不僅能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力和抵抗力，還能防止部分胃腸道疾病的發(fā)生[1-3]。作為一種重要的乳酸菌，植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，厭氧或兼性厭氧，該菌與其他乳酸菌的不同之處在于植物乳桿菌的活菌數(shù)比較高，能大量產(chǎn)酸，而且產(chǎn)出的酸性物質(zhì)能夠降解重金屬。植物乳桿菌常見于肉類、奶油及很多蔬菜發(fā)酵制品中，能通過胃并定植于腸道發(fā)揮益生作用，諸如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、對(duì)致病菌有抑制作用、降低血清膽固醇含量和預(yù)防心血管疾病、緩解乳糖不耐癥等。植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物作為微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，可抑制人或動(dòng)物體內(nèi)常見的致病菌，在食品、飼料等領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。要發(fā)揮益生作用，益生菌必須能夠耐受人體胃腸道中胃酸和膽汁等不良環(huán)境[4-7]。鑒于此，筆者以植物乳桿菌LPL10為研究對(duì)象，分別測(cè)定其耐酸耐膽鹽、抑菌及產(chǎn)酸特性，以期開發(fā)出1株潛在的益生性菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。

植物乳桿菌LPL10來源于農(nóng)家酸豆角（已通過生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析方法鑒定）;指示菌金黃色葡萄球菌SAU08、藤黃微球菌MLU02、綠膿桿菌PPY01來源于廣東省微生物種質(zhì)資源庫。

1.1.2主要試劑及培養(yǎng)基。

膽鹽：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma;其他普通試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.4，配制1 L，固體培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，pH 7.2～7.4，配制1 L，固體培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸三氨2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂200 mg，硫酸錳50 mg，吐溫80 g，pH 6.2±0.2，配制1 L，固體培養(yǎng)基加入1.2%瓊脂粉。

1.1.3主要儀器設(shè)備。顯微鏡：重慶奧特光學(xué)儀器有限公司;752N型紫外可見分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司;生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;PCR儀：Bio-Rad公司;高效液相色譜儀：島津LA20液相色譜儀;低溫冷凍離心機(jī)：Eppendorf 5427 R。

1.2方法

1.2.1耐酸性能研究。用7 mol/L的鹽酸分別調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基pH為2.5、3.0和3.5。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后（菌液中菌的活菌數(shù)為8.1×107 cfu/mL），以2%的接種量分別接種于pH 2.5、3.0和3.5的MRS培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，并在0、2、24 h取樣，稀釋至合適梯度后涂布MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后計(jì)算活菌數(shù)。對(duì)照普通MRS培養(yǎng)基中涂布后的菌落數(shù)，計(jì)算菌的存活率。公式為存活率=N0/Nt×100%，其中N0表示低pH的活菌數(shù)，Nt表示普通MRS的活菌數(shù)。

1.2.2耐膽鹽性能研究。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后（菌液中菌的活菌數(shù)為1.01×108 cfu/mL），以2%的接種量接種于膽鹽濃度分別為0.1%、0.3%和0.5%的MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)，并在0、2、24 h取樣，稀釋至合適梯度后涂布MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后計(jì)算活菌數(shù)。以普通MRS中涂布后的菌落數(shù)為對(duì)照，計(jì)算菌的存活率。公式為存活率=N0/Nt×100%，其中N0表示膽鹽培養(yǎng)基的活菌數(shù)，Nt表示普通MRS的活菌數(shù)。

1.2.3抑菌試驗(yàn)。

1.2.3.1指示菌菌懸液的制備。選取金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌為指示菌，將斜面培養(yǎng)的3種指示菌用4～5 mL生理鹽水洗脫下來，測(cè)其OD600并設(shè)置OD600=4.00±0.01。

1.2.3.2試驗(yàn)平板的制備。將3種指示菌培養(yǎng)基加熱融化并冷卻到40～50 ℃，然后按1 μL/mL的比例添加已調(diào)配好的指示菌菌懸液，搖勻;用滅過菌的移液管分別移取10 mL已調(diào)節(jié)好的各培養(yǎng)基到90 mm培養(yǎng)皿中，待其凝固后用滅過菌的打孔器（直徑2.7 mm）打孔;各孔加入5 μL植物乳桿菌發(fā)酵上清液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌效果，并測(cè)量抑菌圈直徑[8]。

1.2.4測(cè)定產(chǎn)酸能力。將植物乳桿菌LPL10菌種活化后，以2%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結(jié)束后取發(fā)酵液4 mL，離心取上清液，采用0.22 um過濾膜進(jìn)行過濾。液相操作條件為Aminex HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm），線性梯度洗脫，進(jìn)樣量20 uL，示差顯示器檢測(cè)，流動(dòng)相5 mmol/L硫酸，流速為0.6 mL/min，柱溫65 ℃。采用面積外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1耐酸性試驗(yàn)結(jié)果

人體胃酸pH主要維持在2.0～3.0，益生菌通過口服進(jìn)入腸道需經(jīng)過胃的酸性環(huán)境[8]，因此耐酸性試驗(yàn)選取3個(gè)pH，分別為2.5、3.0和3.5。由圖1和2可以看出，植物乳桿菌LPL10具有一定的耐酸能力。MRS培養(yǎng)基pH為2.5時(shí)，LPL10培養(yǎng)2 h活菌數(shù)依然保持在9.35×106 cfu/mL水平，但24 h后活菌數(shù)明顯降低，生長(zhǎng)受到抑制;在培養(yǎng)基pH 3.0條件下，LPL10培養(yǎng)2和24 h后，活菌數(shù)都與初始菌數(shù)保持在同一數(shù)量級(jí)上，說明LPL10已能較好的耐受酸的影響，并保持一定的生長(zhǎng)率;pH為3.5時(shí)，LPL10的生長(zhǎng)已不受抑制，培養(yǎng)24 h存活率達(dá)到148%，顯示出良好的耐受性。

2.2耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果

耐膽鹽試驗(yàn)結(jié)果顯示（圖3和4），隨著培養(yǎng)基膽鹽濃度越高，LPL10存活率逐漸降低。在0.1%膽鹽濃度下LPL10的生長(zhǎng)受膽鹽影響較小，培養(yǎng)2 h活菌數(shù)為1.39×108 cfu/mL，培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)增長(zhǎng)至3.60×108 cfu/mL，存活率達(dá)356%;在0.3%膽鹽濃度下LPL10的生長(zhǎng)已經(jīng)受到較大的抑制，培養(yǎng)24 h存活率為15.3%，但活菌依然維持在107 cfu/mL水平，LPL10雖受到抑制，但也維持一定的生長(zhǎng)率。不同膽鹽濃度下發(fā)酵液pH及OD600與活菌數(shù)保持一致。

2.3抑菌試驗(yàn)結(jié)果

采用打孔法對(duì)植物乳桿菌LPL10的抑菌能力進(jìn)行測(cè)定，抑菌圈直徑越大，表示菌體的抑菌效果越好。試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPL10對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、綠膿桿菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)綠膿桿菌的抑制效果最明顯，其抑菌圈直徑為6.49 mm。由于植物乳桿菌產(chǎn)酸也具有一定的抑菌效果，還需確定LPL10是否具有產(chǎn)細(xì)菌素功能。

2.4產(chǎn)酸特性

產(chǎn)酸是乳酸菌的一個(gè)重要益生特性，產(chǎn)何種酸與產(chǎn)酸能力強(qiáng)弱對(duì)乳酸菌的應(yīng)用具有指導(dǎo)作用[9]。該試驗(yàn)通過高效液相色譜法對(duì)LPL10發(fā)酵產(chǎn)有機(jī)酸能力進(jìn)行了測(cè)定，圖5和6分別是有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品和LPL10發(fā)酵上清液液相圖。對(duì)兩者的有機(jī)酸出峰時(shí)間進(jìn)行比較，結(jié)果顯示LPL10發(fā)酵上清液中主要有機(jī)酸為乳酸及乙酸，經(jīng)過計(jì)算其濃度分別為20.33、25.26 mg/L（表1）。

3結(jié)論與討論

植物乳桿菌是一種被廣泛應(yīng)用于食品、發(fā)酵、青貯等方面的益生菌。隨著研究的深入，近年來植物乳桿菌也逐漸被用作腸道微生態(tài)改善制劑用于改善腸道微生態(tài)環(huán)境，因此對(duì)其各種益生能力的要求也逐漸提高。該研究中菌株LPL10為篩選于食品源的野生菌株，已經(jīng)過生理生化、16S rDNA鑒定確定為植物乳桿菌，并通過體外耐酸耐膽鹽、抑菌、產(chǎn)酸能力試驗(yàn)，對(duì)該株菌的益生特性進(jìn)行了初步研究。耐酸試驗(yàn)中植物乳桿菌LPL10顯示出良好的耐酸能力，能夠耐受pH 3.5的酸性環(huán)境，但其在低酸環(huán)境中的穩(wěn)定性還不夠突出，后續(xù)還有較大的優(yōu)化空間。在0.1%的膽鹽濃度下，LPL10菌落的存活率達(dá)到100%以上。植物乳桿菌LPL10對(duì)常見的致病菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)綠膿桿菌的抑制效果最明顯。液相檢測(cè)結(jié)果顯示，菌株具有良好的產(chǎn)酸能力。LPL10在體外試驗(yàn)中顯示出了良好的益生潛力，后續(xù)可進(jìn)一步優(yōu)化其相應(yīng)特性。

參考文獻(xiàn)

[1] 王水泉，包艷，董喜梅，等.植物乳桿菌的生理功能及應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12（4）：49-55.

[2] 靳志強(qiáng)，王延樣.植物乳桿菌在人體腸道的益生特性[J].中國乳品工業(yè)，2007，35（9）：30-34.

[3] 黃秀敏，張宜靖，李學(xué)優(yōu)，等.植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（24）：6-7，22.

[4]?? LIU Y W，LIONG M T，CHIEH T Y.New perspectives of Lactobacillus plantarum as a probiotic： The gutheartbrain axis[J]. J Microbiol，2018，56（9）：601-613.

[5] 王春光，張雪，李達(dá)，等.酸菜來源植物乳桿菌的分離鑒定與耐受性研究[J].食品科技，2010，35（10）：35-38.

[6] 唐雅茹，于上富，國立東，等.一株降膽固醇乳桿菌的篩選及其益生作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2016，37（1）：142-144，152.

[7] 侯穎，王維宇，牛明福，等.自然發(fā)酵泡菜汁中植物乳桿菌的分離鑒定與體外益生特性研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2017，29（10）：3611-3619.

[8] 甘祥武，黃魁英，曹丁，等.3株植物乳桿菌LPL04、LPL05、LPL14的益生特性[J].食品科技，2017，42（12）：2-5.

[9] 林龍鎮(zhèn)，鄒衛(wèi)玲，李安章，等.產(chǎn)酸、耐酸乳酸菌的分離鑒定及益生特性[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39（2）：95-102.