林兆威 李超萍 時(shí)濤 王國(guó)芬 李博勛 蔡吉苗 黃貴修

摘? 要? NAC（NAM/ATAF/CUC）基因家族是廣泛分布于陸生植物的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本文對(duì)該基因家族在木薯抗細(xì)菌性萎蔫病方面的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。采用RT-PCR技術(shù)從木薯cDNA中克隆了MeNAC29和MeNAC30基因，并采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)抗、感種質(zhì)受木薯萎蔫病菌（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，Xam）侵染后2個(gè)基因的表達(dá)變化進(jìn)行了定量分析。結(jié)果表明，2個(gè)基因均含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，且均有保守的NAM結(jié)構(gòu)域。MeNAC29基因的開放閱讀框全長(zhǎng)888 nt，編碼295 aa。MeNAC30基因的開放閱讀框全長(zhǎng)870 nt，編碼289 aa。接種木薯萎蔫病菌后，抗病種質(zhì)中MeNAC29和MeNAC30基因的表達(dá)量顯著高于感病品種，表明這2個(gè)基因參與了木薯對(duì)細(xì)菌性萎蔫病菌的抗性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞? 木薯;MeNAC29基因;MeNAC30基因;表達(dá)分析中圖分類號(hào)? S533? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

Abstract? The NAC （NAM/ATAF/CUC） transcription factor gene family was widely distributed in terrestrial plants and plays an important role in the regulation of growth and stress responses. The preliminary research about the role of this gene family on the cassava against bacterial blight was carried out in our lab. Two genes， MeNAC29 and MeNAC30， were cloned from cassava cDNA by RT-PCR， the different expression changes between resistant and susceptible cassava germplasms infected by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis （Xam） were also quantified by qRT-PCR. The results showed both MeNAC29 and MeNAC30 contain three exons， two introns， and conserved NAM domain. The length of MeNAC29 genes ORF was 888 nt， which encode 295 amino acids， while the MeNAC30 genes ORF was 870 nt and encode 289 amino acids. Compared with susceptible cassava germplasms， both two genes expression was significantly increased in the resistant cassava germplasms - Xanthomonas axonopodis pv. manihotis interaction， which showed they are involved in resistance response of cassava to bacterial blight.

Keywords? cassava; MeNAC29 gene; MeNAC30 gene; expression analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.012

由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xan tho monas axonopodis pv. manihotis，簡(jiǎn)稱Xam）引起的木薯細(xì)菌性萎蔫?。ㄒ卜Q細(xì)菌性枯萎病或細(xì)菌性疫病）是一種世界性病害，可造成木薯產(chǎn)量嚴(yán)重?fù)p失，甚至毀種絕收[1]。近年來(lái)，該病在廣西、廣東、海南等地區(qū)頻發(fā)流行，在廣西貴港、廣東湛江等地區(qū)為害嚴(yán)重。培育和種植抗?。ɑ蚰筒。┢贩N是防治該病最有效的方法之一，但由于對(duì)木薯細(xì)菌性萎蔫病的抗病機(jī)制缺少研究，嚴(yán)重限制了相關(guān)工作的開展。

NAC基因家族是廣泛分布于陸生植物的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。1996年Souer等[3]首次從矮牽牛中發(fā)現(xiàn)NAC基因家族。目前已確定擬南芥中有117個(gè)[4]、煙草中有152個(gè)[5]、水稻中有151個(gè)[6]、葡萄中有74個(gè)[7]、棉花中有145個(gè)NAC成員[8]。功能分析證實(shí)NAC家族部分基因參與植物抗病性調(diào)控作用，其中的ATAF亞類基因不僅在結(jié)構(gòu)上相似，在脅迫響應(yīng)上也具有保守性[9]。擬南芥ATAF類基因ATAF1的過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)擬南芥對(duì)丁香假單胞桿菌番茄致病變種的敏感性[10]，而過(guò)表達(dá)ATAF2能抑制尖胞鐮刀菌相關(guān)蛋白的合成[11]。辣椒受細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原侵染時(shí)，ATAF類基因CaNAC1的表達(dá)量快速增加，通過(guò)作用于病原侵染信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提高抗病性[12]。孫利軍[13]研究發(fā)現(xiàn)，水稻中ATAF類基因OsNAC4在水稻與白葉枯病菌的非親和性互作過(guò)程中上調(diào)表達(dá)。

目前有關(guān)NAC家族在木薯抗病反應(yīng)中的作用研究還很缺乏。Hu等[14]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，鑒定了木薯基因組中有96個(gè)NAC基因并將其分成16類，其中屬于ATAF類（MeNAC29和MeNAC30）的MeNAC29在滲透、鹽、冷、H2O2及脫落酸等處理中被誘導(dǎo)表達(dá)，分析MeNAC29和MeNAC30有可能參與木薯的抗病反應(yīng)。本研究開展了這2個(gè)基因的克隆及其在木薯抗、感病種質(zhì)受細(xì)菌性萎蔫病菌侵染過(guò)程中的差異表達(dá)分析，以期為進(jìn)一步的調(diào)控作用機(jī)理研究和抗病育種工作提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試木薯抗病種質(zhì)為‘優(yōu)抗9號(hào)（RXC9）、‘優(yōu)抗10號(hào)（RXC10）和‘優(yōu)抗11號(hào)（RXC11），感病品種為‘華南205（SC205）、‘桂熱4號(hào)（GR4）和‘華南8號(hào)（SC8），木薯種莖、細(xì)菌性萎蔫病菌菌株XamGX11均由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈試劑盒FastQuant RT kit（With gDNase）、SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司。pMD-18T載體、Taq DNA聚合酶、dNTP等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。DNA Marker、Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物合成與測(cè)序由北京六合華大基因股份有限公司完成。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌接種? 病原菌菌株活化后，用YGP培養(yǎng)基（參照《植病研究方法》[15]的配方制備）培養(yǎng)并制備3×108 cfu/mL的菌液。參照盧昕等[16]的方法，將木薯種莖種植于直徑30 cm的塑料花盆中，常規(guī)管理2個(gè)月后，在日平均氣溫30 ℃條件下，選擇完全展開、完全轉(zhuǎn)綠、無(wú)病蟲危害的健康葉片，用注射法進(jìn)行人工活體接種，分別在接種后0、12、24、48、72 h取葉片樣品。

1.2.2? 木薯葉片RNA提取及合成第一鏈cDNA? 木薯葉片RNA提取參照RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書，合成第一鏈cDNA參照FastQuant cDNA試劑盒明書。

1.2.3? MeNAC29、MeNAC30的克隆? 以獲得的第一鏈cDNA為模板，根據(jù)NCBI上登錄的木薯種質(zhì)為AM560-2的NAC29（GenBank登錄號(hào)：XM_021773675.1）和NAC30（GenBank 登錄號(hào)：XM_021748980.1）設(shè)計(jì)特異性引物（表1）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化后，選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4? MeNAC29、MeNAC30生物信息學(xué)分析? 利用NCBI在線工具、ProtParam、TMHMM、SignalP、Promoter Scan、SOPMA、SWISS-MODEL等軟件分析目的基因的結(jié)構(gòu)、同源性、編碼蛋白理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、聚類分析等。

1.2.5? MeNAC29、MeNAC30在木薯-細(xì)菌性萎蔫病菌互作過(guò)程中的差異表達(dá)分析? 根據(jù)克隆的

MeNAC29、MeNAC30的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），以各樣品的第一鏈cDNA為模版，參照SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s（熒光信號(hào)采集），共40個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 9.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析[17]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? MeNAC29與MeNAC30的克隆與序列分析

2.1.1? MeNAC29與MeNAC30的克隆及核苷酸序列分析? 提取木薯種質(zhì)RXC9、RXC11及GR4樣品RNA，并合成第一鏈cDNA。以cDNA作為模板，克隆得到的MeNAC29基因片段長(zhǎng)度分別為1020、1019、1010 nt，3個(gè)核苷酸序列之間的同源性在97.36%以上，均有一個(gè)全長(zhǎng)為888 nt的ORF，預(yù)測(cè)其編碼295 aa，且3個(gè)氨基酸序列之間同源性為99.77%;與木薯基因組（品種AM560-2）比對(duì)發(fā)現(xiàn)[18]，MeNAC29含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）位于起始密碼子上游1084 nt處（圖1）。木薯種質(zhì)RXC9、RXC11及GR4的MeNAC30克隆片段長(zhǎng)度分別為1213、1163、1184 nt，序列之間同源性均在94.77%以上，均有一個(gè)全長(zhǎng)為870 nt的ORF，預(yù)測(cè)其編碼289 aa，3個(gè)氨基酸序列之間同源性為99.65%;與木薯基因組（品種AM560-2）本地Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，MeNAC30含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）位于起始密碼子上游2376 nt處（圖2）。分析MeNAC29基因編碼蛋白含有TFIID元件和JunB-US2元件，MeNAC30基因含TFIID元件、CTF/NF-1和CTF元件;2個(gè)基因起始密碼子上游均無(wú)CpG island 。

2.1.2? MeNAC29與MeNAC30氨基酸序列分析? ?分析結(jié)果表明，MeNAC29編碼蛋白的分子質(zhì)量為34.02 ku，等電點(diǎn)為6.46，含正電荷氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為39，含負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為41，在組成肽鏈的20種氨基酸中，賴氨酸（Lys）含量最高，占8.5%（表2）。MeNAC30編碼蛋白的分子質(zhì)量為32.76 ku，等電點(diǎn)為7.61，

含正電荷氨基酸殘基數(shù)（Arg+Lys）為36，含負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)（Asp+Glu）為35，組成肽鏈的20中氨基酸中，脯氨酸（Pro）含量最高，占9.0%（表2）。 2個(gè)基因均不含吡咯賴氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）密碼子，預(yù)測(cè)結(jié)果顯明二者表達(dá)的蛋白質(zhì)均不穩(wěn)定且無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)域。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，MeNAC29與MeNAC30預(yù)測(cè)蛋白均含有NAC家族保守的NAM結(jié)構(gòu)域，并在N端具有高度的相似性，均含α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)（圖3）。以水稻NAC家族的NAC1為模型，獲得了2個(gè)蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（圖4、圖5），且與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致。

2.2? 聚類分析

選取與MeNAC29蛋白同源的14個(gè)NAC蛋白進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，MeNAC29與MeNAC30位于2個(gè)完全不同的分枝，MeNAC30與同屬于大戟科的麻風(fēng)樹親緣關(guān)系最近，與十字花科的擬南芥、蘿卜較近;MeNAC29與同屬于大戟科的蓖麻、橡膠親緣關(guān)系最近，與豆科的大豆、鷹嘴豆較近;葫蘆科的黃瓜、南瓜和茄科的辣椒、西紅柿，均與MeNAC29與MeNAC30親緣關(guān)系較遠(yuǎn);單子葉植物玉米、粳稻、小麥另聚為一類（圖6）。

2.3? MeNAC29、MeNAC30基因在木薯-細(xì)菌性萎蔫病菌互作過(guò)程中的差異表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)（RXC9、RXC10、RXC11）在接種XamGX11 48 h時(shí)，MeNAC29 與MeNAC30的表達(dá)量高于對(duì)照（0 h），說(shuō)明抗病種質(zhì)接種病原菌后2個(gè)基因的表達(dá)被誘導(dǎo);而感病種質(zhì)（SC205、GR4、SC8）在接菌后所有取樣點(diǎn)的MeNAC29 與MeNAC30表達(dá)量均低于對(duì)照（0 h），說(shuō)明感病種質(zhì)接病原菌后2個(gè)基因表達(dá)受到抑制?？?、感種質(zhì)之間比較發(fā)現(xiàn)，抗病種質(zhì)MeNAC29 與MeNAC30基因表達(dá)量在侵染過(guò)程中均顯著高于感病種質(zhì)（P< 0.05）。MeNAC29在抗病種質(zhì)中的表達(dá)模式相似，均呈先下降后上升再下降的規(guī)律;MeNAC29 與MeNAC30在RXC9中表達(dá)模式均呈先下降后上升再下降的規(guī)律（圖7）?？傊共》N質(zhì)被病原菌侵染后MeNAC29 與MeNAC30能被誘導(dǎo)表達(dá)，而感病種質(zhì)接種病原菌后基因表達(dá)受到抑制，抗病種質(zhì)MeNAC29和MeNAC30的表達(dá)量顯著高于感病種質(zhì)。故認(rèn)為MeNAC29 與MeNAC30參與木薯和Xam之間的互作反應(yīng)。

3? 討論

本研究從木薯種質(zhì)RXC9、RXC11、GR4中克隆了MeNAC29和MeNAC30基因，其預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)與絕大部分NAC家族成員相似[19-20]，N端均含有一個(gè)高度保守的NAM結(jié)構(gòu)域，核苷酸序列比對(duì)同源性達(dá)到97%以上，氨基酸序列比對(duì)僅存在1個(gè)aa的差異，表明這些蛋白的功能具有很強(qiáng)的保守性。聚類分析顯示MeNAC29與MeNAC30位于不同的分支上，可能與NAC家族成員C端多樣性較高、保守性較低有關(guān)，由于C端作為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，主要起轉(zhuǎn)錄激活的作用[21-23]，故對(duì)其功能的發(fā)揮影響不大。本研究發(fā)現(xiàn)受Xam侵染后，抗病種質(zhì)中MeNAC29和MeNAC30的表達(dá)量均顯著升高，而感病種質(zhì)中的表達(dá)量則下調(diào)，分析MeNAC29和MeNAC30參與木薯抗Xam侵染過(guò)程，與該基因家族成員的功能研究結(jié)果基本相似[13-14]。

相關(guān)研究表明，木薯對(duì)細(xì)菌性萎蔫病菌的抗性是一種數(shù)量遺傳關(guān)系。Jorge等[24]研究發(fā)現(xiàn)木薯有8個(gè)數(shù)量遺傳性狀基因和抗性相關(guān)，能夠解釋9%～20%的表型差異。Wydradeng 等[25]利用木薯種質(zhì)CM2177-2和TMS30572的雜交子代及其回交代進(jìn)行了4個(gè)病菌分離物的接種試驗(yàn)，結(jié)果表明這些子代中有16種基因型呈現(xiàn)不同水平的抗性反應(yīng)。Wang等[26]比較了野生木薯（W14）和栽培種木薯（KU50）基因組，發(fā)現(xiàn)其具有高度雜合性和數(shù)百萬(wàn)個(gè)單核苷酸變異。而本研究所選用的木薯抗性種質(zhì)和主栽品種均為人工選育而來(lái)，遺傳背景復(fù)雜。MeNAC29和MeNAC30基因在抗、感病種質(zhì)受病菌侵染時(shí)的表達(dá)量變化及變化趨勢(shì)并不相同，分析不同種質(zhì)的抗病性反應(yīng)調(diào)控機(jī)制之間的差異將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

NAC基因家族成員之間存在功能冗余現(xiàn)象，如擬南芥的NAC019/ANAC055、ATAF2/At5g63790為功能冗余基因?qū)?，這些基因?qū)Φ膯蝹€(gè)基因插入突變或沉默不會(huì)引起表型改變，只有2個(gè)基因同時(shí)突變時(shí)才有表型改變[27-28]。由于MeNAC29與MeNAC30在RXC9中表達(dá)模式相似，二者之間是否存在基因功能冗余現(xiàn)象還有待進(jìn)一步研究。

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