多效唑?qū)γ⒐麍@土壤細(xì)菌多樣性的影響及PICRUSt基因功能預(yù)測分析

靳曉拓 周彥妤 夏楊榮暢 陳麗君 李濤 趙洪偉

摘? 要? 為了探究多效唑?qū)γ⒐麍@土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響，本研究以海南樂東某芒果園為研究對象，設(shè)置施用和不施用多效唑的土壤分別為處理組和對照組，通過Illumina Miseq測序平臺對芒果園土壤進行16S rRNA高通量測序分析。2組樣品通過高通量測序共得到3586個OTUs（operational taxonomic units），可注釋到38個門、89個綱、195個目、378個科、673個屬、1353個種。Alpha多樣性分析表明，施用多效唑后，土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)顯著高于同時期未施用多效唑的土壤;但施藥后土壤的細(xì)菌多樣性顯著降低。主成分分析表明，施用多效唑?qū)ν寥兰?xì)菌的群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。與對照組相比，施用多效唑的土壤中變形菌門和浮霉菌門等含量顯著增高，而放線菌門和厚壁菌門等含量顯著降低。PICRUSt功能預(yù)測分析結(jié)果表明，芒果園土壤細(xì)菌主要涉及細(xì)胞生長與死亡、碳水化合物代謝、次生產(chǎn)物代謝的生物合成、氨基酸代謝等43個子功能，表現(xiàn)出功能上的豐富性。多效唑處理后，會降低土壤細(xì)菌的整體代謝能力。由此可見，施用多效唑會降低土壤細(xì)菌的多樣性，改變土壤細(xì)菌的相對豐度，且對土壤細(xì)菌的功能會有一定的影響。

關(guān)鍵詞? 多效唑;芒果園;土壤;細(xì)菌多樣性;PICRUSt分析中圖分類號? S154.3;X592? ? ? 文獻標(biāo)識碼? A

Abstract? The Illumina Miseq 16S rRNA high-throughput sequencing technology was used to study the bacterial community structure and diversity of two group soil samples with and without paclobutrazol treatment， respectively， from a mango orchard in Ledong， Hainan. A total of 3586 operational taxonomic units （OTUs） in two groups were obtained， which were classified as 38 phylums， 89 classes， 195 orders， 378 families， 673 genera and 1353 species. The results of the analysis of Alpha diversity showed that soil bacterial richness index was significantly higher in the paclobutrazo-treated soils， however compared with the soils without paclobutrazol treatment， the bacterial diversity was significantly decreased. The principal component analysis indicated that the community structure of soil bacteria was affected by paclobutrazol. The quantities of Proteobacteria and Planctomycetes were significantly increased in the paclobutrazol-treated soils， however， those of Actinobacteria and Firmicutes were significantly decreased. The PICRUSt analysis showed that the functional gene families were mainly related to 43 sub-functions including the cell growth and death， carbohydrate metabolism， biosynthesis of secondary metabolites， amino acid metabolism， and so on. The total metabolic capacity of soil bacteria could be reduced after treated with paclobutrazol. Therefore， the application of paclobutrazol can reduce the diversity of soil bacteria， and it also has some impacts on the relative abundance and functions of soil bacteria.

Keywords? paclobutrazol; mango orchard; soil; bacterial diversity; PICRUSt analysis

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.027

我國是芒果原產(chǎn)地之一，近些年芒果的種植面積不斷擴大，產(chǎn)量逐年增加，已成為一些地方的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)[1]。隨著芒果產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模發(fā)展，其生產(chǎn)過程中農(nóng)藥的不合理使用問題日益嚴(yán)峻。多效唑是一種三唑類植物生長調(diào)節(jié)劑，在芒果園土壤中有較大的施用量，主要用在芒果樹的控梢、提高芒果產(chǎn)量[2-4]等方面。但多效唑在土壤中的殘留期較長，其半衰期在半年到一年[4]，土壤中殘留的多效唑可能會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的平衡[5]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[6]，土壤微生物可以敏感地反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化，同時是土壤中生物活性的具體體現(xiàn)[7]。微生物與土壤健康狀況的關(guān)系密切，對生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)具有重要作用[8]。土壤中微生物以細(xì)菌數(shù)量最多，占土壤微生物總量的70%以上，細(xì)菌群落中含有大量具有特殊功能的生理類群，如固氮菌、氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌等[9]。細(xì)菌種類或豐度的變化，會對這些特定生理類群的數(shù)量產(chǎn)生直接影響，從而影響土壤肥力，如放線菌對植物病蟲害防治有著重要的作用[10]。并且農(nóng)藥的施用會對土壤微生物產(chǎn)生一定的影響，從而影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

目前關(guān)于土壤微生物多樣性的研究多采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法[11-14]，但平板培養(yǎng)法具有較大的局限性，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法得到的微生物只占環(huán)境微生物總數(shù)極少的一部分[15]。隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，PCR-SSCP[16]、PLFA[17]、DGGE和高通量測序技術(shù)[18-20]等一些新的方法在土壤微生物的研究中得到應(yīng)用。其中，高通量測序技術(shù)可以避免微生物分離培養(yǎng)的過程，能夠準(zhǔn)確、快速、高通量地解讀土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的變化情況，與其他方法相比，具有通量大、準(zhǔn)確率高、成本低等優(yōu)點[21]，更加適合土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析。目前利用高通量測序的方法研究土壤微生物的報道有很多，但是，尚未有通過高通量測序的方法研究多效唑?qū)ν寥牢⑸锒鄻有杂绊懙膱蟮?。同時，傳統(tǒng)的方法無法對微生物的功能進行研究，16S rRNA高通量測序可以通過PICRUSt（phylo genetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）軟件預(yù)測基因序列對應(yīng)的細(xì)菌菌群代謝功能譜。PICRUSt功能預(yù)測分析相較于宏基因組研究更加方便且成本也更低，同時預(yù)測效果具有較高的可靠性[22]。目前該方法已在珊瑚礁[23]、海水[24]、庫區(qū)[25]、土壤[26-28]等不同生境中得到良好的應(yīng)用，而關(guān)于多效唑?qū)γ⒐麍@土壤微生物的研究還未見報道。

海南是我國主要的芒果種植區(qū)，據(jù)《2017年海南省統(tǒng)計年鑒》，樂東黎族自治縣的芒果種植面積達到10 341 hm2，位居海南省第二。本研究以海南省樂東黎族自治縣黃流鎮(zhèn)某芒果園為研究對象，通過高通量測序技術(shù)研究了施用多效唑前后芒果園土壤微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)合PICRUSt分析預(yù)測多效唑?qū)γ⒐麍@土壤微生物功能的影響，為合理施用多效唑和評價多效唑?qū)r(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 土壤樣品采集與處理

土壤樣品采集參照《土壤農(nóng)化分析》[29]，在處理前后試驗組和對照組各設(shè)置3個采樣區(qū)域，去除表層土壤，每個采樣區(qū)采集6～8個點的土壤混勻，放置冰盒中帶回實驗室儲存于?80 ℃冰箱，用于DNA提取及細(xì)菌16S rRNA測序分析。

1.2? 試驗設(shè)計

試驗基地位于海南省樂東黎族自治縣黃流鎮(zhèn)某芒果園。該地區(qū)屬于熱帶季風(fēng)氣候，土壤為砂質(zhì)壤土，光熱充足，年平均氣溫為25 ℃，年降雨量為1400～1800 mm。在基地內(nèi)選取未使用過多效唑的幼齡芒果樹區(qū)域，設(shè)置試驗組（T）和對照組（C），試驗組施用多效唑量為1.5 g/m2（以多效唑有效成分計），分多效唑施用前（T0）和施用后30 d （T30）2個時期進行樣品采集;對照組采樣時期同試驗組，分為C0和C30 2個時期。試驗前土壤基本參數(shù)如表1所示。

1.3? 檢測方法

土壤DNA采用MOBIO土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil? DNA Isolation kit）進行提取，細(xì)菌PCR擴增采用V4-V5可變區(qū)的細(xì)菌通用引物515F（GTGCCAGCMGCCGCGGTAA）和907R（CCGTCAATTCMTTTRAGTTT）。PCR擴增體系及擴增條件參照文獻[30]進行。土壤DNA樣品經(jīng)過PCR質(zhì)量驗證合格后，送至廣州賽哲生物科技股份有限公司利用Illumina Miseq測序平臺進行16S rRNA序列測定。

1.4? 數(shù)據(jù)處理

采用FLASH v1.2.7軟件進行序列拼接，對拼接得到的序列進行過濾。采用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。測序得到的序列經(jīng)拼接過濾后，提交到美吉云平臺進行數(shù)據(jù)處理分析。采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 樣品信息統(tǒng)計

通過Illumina高通量測序平臺對芒果園土壤細(xì)菌16SrRNA 的V4-V5區(qū)進行序列測定，12個樣品測序共獲得454 320條原始序列，經(jīng)過濾后共產(chǎn)生445 976條有效序列，每個樣品至少產(chǎn)生36 557條有效序列，平均產(chǎn)生37 165條有效序列。對測序結(jié)果基于97.00%的相似度進行聚類，共得到3586個OTUs。

根據(jù)樣品稀釋曲線可以看出，12個樣品的曲線均有趨于平坦的趨勢（圖1），表明樣品測序量合理，OTUs的覆蓋度高，測序深度可以滿足試驗要求。

采用Venn圖2展示4組樣品所含OTUs，4組樣品共有的核心OTUs個數(shù)為1841個。C0共有2468個OTUs，C30共有3143個OTUs;T0共有2439個OTUs，T30共有2877個OTUs。4組樣品中的細(xì)菌在OTUs水平上存在差異;施用多效唑后，土壤中總物種類別和特有物種類別減少。與對照組（C30）相比，經(jīng)多效唑處理后（T30），土壤中OTUs個數(shù)減少。

2.2? Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可用來反映樣本中微生物的豐度和多樣性。采用群落豐富度指數(shù)Sobs、Ace和Chao以及群落多樣性指數(shù)Shannon和Simpson對施用多效唑后芒果園土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化情況進行評估，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，試驗樣品具有豐富的群落組成，施用多效唑后，樣本細(xì)菌群落豐富度和多樣性有顯著的變化。C0和T0的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)沒有顯著差異。但T30的群落豐富度指數(shù)Ace顯著高于C30，T30的物種多樣性指數(shù)Shannon和Simpson顯著低于C30。Ace指數(shù)越大，表明土壤中細(xì)菌的數(shù)目越多;多樣性指數(shù)越大，表明土壤中每個物種的個數(shù)越平均，物種分布越均勻。施用多效唑后，土壤細(xì)菌總數(shù)目增多，但各物種的數(shù)目差異較大，不同種類的細(xì)菌分布不均勻。

2.3? 物種組成分析

將測序得到的3586個OTUs與silva128/16s_ bacteria物種分類數(shù)據(jù)庫進行比對，可注釋到38個門、89個綱、195個目、378個科、673個屬、1353個種。在門水平上對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進行分析，結(jié)果表明樣品豐度大于1%的有變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）以及1個未分類菌門（unclassified k-norank），這10個細(xì)菌門為樣品土壤中的優(yōu)勢菌群。施用多效唑的土壤T30和對照組C30在細(xì)菌門的相對豐度有了明顯的變化，而C0和T0在細(xì)菌門水平上的相對豐度沒有顯著差異，說明所選試驗區(qū)域的對照組和試驗組土壤細(xì)菌無顯著差異（圖3A）。施用多效唑的土壤T30中，變形菌門、綠彎菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門和硝化螺旋桿菌門等的相對豐度顯著高于對照組土壤C30;放線菌門和厚壁菌門的相對豐度顯著低于C30（圖3B）。

2.4? Beta多樣性分析

Beta多樣性分析是通過微生物群落構(gòu)成的比較，考慮物種豐度和均勻度，評估不同微生物群落間的差異情況。主成分分析（PcoA）用來反映不同處理樣本群落組成的相似性或差異。在屬水平上對物種豐度進行主成分分析，在第一個時期，C0與T0的距離較近，表明試驗進行前C組和T組樣本組成較為類似;在第二個時期，T30與C30的樣點較為分散，在圖中的距離較遠(yuǎn)，表明經(jīng)多效唑處理后土壤的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有了較大的改變（圖4）。

2.5? PICRUSt功能預(yù)測分析

為了探究施用多效唑后土壤細(xì)菌的功能變化情況，本研究采用PICRUSt軟件進行菌群預(yù)測分析。基于KEGG數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）預(yù)測的結(jié)果表明：在一級功能層共獲得6類生物代謝通路功能分析：代謝（metabolism）、遺傳信息處理（genetic information processing）、環(huán)境信息處理（environmental information processing）、細(xì)胞過程（cellular processes）、有機系統(tǒng)（organismal systems）和人類疾?。╤uman diseases）。其中代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理為其主要組成，占比分別為51.73%～52.36%、15.28%～15.39%和13.11%～13.71%。

同時對預(yù)測基因二級功能層進行分析，發(fā)現(xiàn)其由細(xì)胞生長與死亡（cell growth and death）、折疊、分類和降解（folding，sorting and degradation）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、次生產(chǎn)物代謝的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）等43個子功能組成。對二級功能層預(yù)測基因拷貝數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)T30 和C30共有25個二級功能層預(yù)測基因的拷貝數(shù)存在顯著差異（圖5）。施用多效唑的處理組T30中有細(xì)胞生長與死亡（cell growth and death）、折疊、分類和降解（folding，sorting and degradation）、內(nèi)分泌代謝疾病（endocrine and metabolic diseases）、細(xì)胞運動（cell motility）、膜運輸（membrane transport）、能量代謝（energy metabolism）、循環(huán)系統(tǒng)（circulatory system）、輔助因子和維生素的代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、全局和概覽地圖（global and overview maps）、免疫系統(tǒng)（immune system）和傳染病：細(xì)菌（infectious diseases： Bacterial）11個子功能預(yù)測基因的拷貝數(shù)大于空白對照組C30;T30中的碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、次生產(chǎn)物代謝的生物合成（biosynthesis of other secondary metabolites）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、神經(jīng)系統(tǒng)（nervous system）、多糖生物合成和代謝（glycan biosynthesis and metabolism）、運輸和分解代謝（transport and catabolism）、免疫系統(tǒng)疾病（immune diseases）、物質(zhì)依賴（substance dependence）、類脂化合物代謝（lipid metabolism）、傳染?。杭纳╥nfectious diseases： Parasitic）、心血管疾?。╟ardiovascular diseases）、環(huán)境適應(yīng)（environmental adaptation）、排泄系統(tǒng)（excretory system）和內(nèi)分泌系統(tǒng)（endocrine system）14個子功能預(yù)測基因的拷貝數(shù)小于C30。

3? 討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)中起著不可或缺的作用。土壤中大部分的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過程是微生物活動引起的，凡能改變微生物數(shù)量或活性的任何化合物都會影響土壤的生化過程，最終影響土壤肥力和植物生長[31]。農(nóng)藥的施用會對土壤微生物產(chǎn)生一定的影響，施用農(nóng)藥后，土壤環(huán)境會發(fā)生變化，土壤微生物之間的穩(wěn)定性、土壤微生物的生物量及活性會降低。目前，關(guān)于農(nóng)藥對土壤微生物影響的研究日益增加，目前的報道有有機磷類[32]、有機氯類[33]和三唑類[11-14， 34-35]等。

現(xiàn)有關(guān)于多效唑?qū)ν寥牢⑸锏挠绊懙难芯繄蟮蓝嗖捎闷桨迮囵B(yǎng)法進行，趙秀芬等[11]、袁志華等[12]、Gon?alves等[13]、Silva等[14]等均采用此方法研究了多效唑?qū)ν寥牢⑸锒鄻有?、生物量的影響，由于試驗方法的限制均未對土壤?xì)菌群落組成進行研究。本研究采用高通量測序技術(shù)研究了多效唑?qū)γ⒐麍@土壤細(xì)菌的影響，發(fā)現(xiàn)施藥后的土壤細(xì)菌多樣性顯著降低，這與前人[11， 13-14]的研究結(jié)果一致。Alpha多樣性分析表明施用多效唑后，土壤細(xì)菌的豐富度降低，與Silva等[14]的報道一致;細(xì)菌群落多樣性降低，這可能與多效唑減少了芒果園中土壤細(xì)菌的種類有關(guān)。本研究的結(jié)果與Kuo等[36]的研究結(jié)果一致，與同時期未施用多效唑的芒果園土壤相比，施用多效唑的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有了較大的改變。通過物種群落組成分析，發(fā)現(xiàn)多效唑?qū)ν寥乐凶冃尉T和放線菌門的細(xì)菌影響最大，施用多效唑后，土壤中變形菌門的豐度顯著提高，放線菌門的豐度顯著降低，放線菌對植物病害具有十分明顯的防治作用，放線菌含量的降低可能會導(dǎo)致植物病害發(fā)生[10]。本研究結(jié)果表明施用多效唑會減少土壤細(xì)菌的物種種類，打破土壤微生態(tài)平衡，可能使原本供給某類細(xì)菌的養(yǎng)分被其他細(xì)菌利用，增大了其他細(xì)菌的數(shù)量，雖然提高了土壤中細(xì)菌總體的豐富度，但減少了土壤中的細(xì)菌種類，導(dǎo)致土壤的細(xì)菌多樣性降低。

之前關(guān)于多效唑?qū)γ⒐麍@細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究主要關(guān)注土壤微生物量的變化情況，對其功能的研究開展較少。農(nóng)藥殘留會使土壤中的功能微生物含量發(fā)生改變，具有降解污染物功能的微生物含量增多[37-39]。PICRUSt分析通過與數(shù)據(jù)庫比對，將微生物的變化情況和生物功能聯(lián)系起來[40]。施用多效唑前后土壤微生物的相對豐度發(fā)生改變，其功能也發(fā)生相應(yīng)的變化，本研究將高通量測序結(jié)果進行PICRUSt功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)施用多效唑后，在一級功能層和二級功能層的預(yù)測基因拷貝數(shù)整體趨勢低于對照組。該結(jié)果初步揭示了施用多效唑后芒果園土壤細(xì)菌功能的差異，但鑒于PICRUSt功能預(yù)測分析的局限性，后續(xù)需要結(jié)合宏基因組測序等技術(shù)進一步分析。

4? 結(jié)論

本研究初步探明了施用多效唑后芒果園土壤細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化情況，施用多效唑會減少土壤OTUs的數(shù)目，降低土壤細(xì)菌的多樣性;多效唑會改變芒果園土壤的細(xì)菌相對豐度，施用多效唑后，變形菌門的豐度顯著提高，放線菌門的豐度顯著降低;通過PICRUSt功能預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)施用多效唑后，土壤細(xì)菌的功能有一定的改變，土壤的預(yù)測基因拷貝數(shù)在一級功能層和二級功能層上均低于對照組。本研究采用高通量測序技術(shù)研究了多效唑?qū)γ⒐麍@土壤微生物的影響，對評價多效唑?qū)γ⒐麍@土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響進而指導(dǎo)合理施用多效唑具有重要意義。

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