方亞妮,劉金輝,石小玲,戴鵬高

(1.陜西中醫(yī)藥大學 醫(yī)學技術(shù)學院,陜西 西安 712046;2.西北大學 生命科學學院,陜西 西安 710069)

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。根據(jù)中國癌癥流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)統(tǒng)計,2015年我國確診為肺癌的人數(shù)高達73.3萬,發(fā)病率在所有癌癥中占據(jù)首位;肺癌死亡病例為61.0萬人,死亡人數(shù)居癌癥首位[1]。近年來其發(fā)病率和死亡率也有日益增加的趨勢。非小細胞肺癌占肺癌病理類型的80%左右[2],可近一步分為大細胞癌,鱗狀細胞癌及腺癌3種類型,其中腺癌患者所占比重最高,50%左右[3]。由于病情的隱匿性,大多數(shù)肺腺癌患者在確診時已處于晚期,無法進行手術(shù)治療,因此以鉑類藥物為基礎的放化療成為這些患者治療的主要的臨床手段[4],其中順鉑作為化療的一線藥物一直被沿用至今[5]。

然而,患者在長期使用順鉑過程中對其產(chǎn)生的獲得性耐藥使得他們的治療效果大大降低[6]。因此,發(fā)現(xiàn)與順鉑耐藥密切相關(guān)的分子標志物對改善肺腺癌患者的治療現(xiàn)狀有著重大的意義。本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果揭示醛酮還原酶家族1(Aldo-Keto Reductases family 1,AKR1)的3個成員AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1在A549順鉑耐受株中表達量顯著提升[7],提示了這3個基因可能與肺腺癌患者順鉑耐藥相關(guān),但目前尚缺少系統(tǒng)性的研究闡明該家族基因在肺腺癌順鉑獲得性耐藥中的作用。本研究基于抑制劑阻斷,RNAi敲減等細胞功能性實驗對AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1這3個基因在肺腺癌順鉑耐藥中的作用進行了初步的探究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基,胎牛血清,雙抗預混液均購自美國Gibco公司。順鉑購自美國Sigma公司。RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司。Real-time qPCR試劑盒One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit II購買于日本TaKaRa公司。實時定量pcr引物和抑制劑Salicylate購自上海生工生物工程有限公司。抑制劑Epalrestat與Medroxyprogesterone acetate購自美國Selleck Chemicals公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所。Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine?2000購自美國Life technologies公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

肺腺癌A549細胞購自中國科學院上海細胞庫。耐順鉑細胞株A549/DDP由本課題組體外誘導構(gòu)建,耐藥指數(shù)為3.4[7]。A549細胞培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))胎牛血清、100U/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的雙抗預混液的RPMI-1640培養(yǎng)基中。A549/DDP培養(yǎng)在順鉑濃度為2μmol/L的RPMI-1640培養(yǎng)基中,其他條件相同。A549細胞和構(gòu)建得到的A549/DDP細胞首先要經(jīng)過單克隆篩選以降低遺傳背景對后續(xù)實驗的干擾。將兩種細胞稀釋到每毫升10個細胞,加入96孔板中,每板200μL。培養(yǎng)24h后顯微鏡下觀察,標記只有一個細胞存活的孔,并對這些孔進行重點觀察,每2～3天更換一次新鮮培養(yǎng)基,待細胞在孔中富集后將其轉(zhuǎn)移到24孔板中擴大培養(yǎng),直至培養(yǎng)得到可以正常繁殖傳代的單克隆A549/DDP和A549細胞。后續(xù)實驗中所提到的A549細胞和A549/DDP細胞均為經(jīng)過單克隆篩選過的細胞。實驗時細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

將A549/DDP及其親本細胞A549在轉(zhuǎn)錄組水平對其表達量差異進行分析比較。我們首先使用Illumina公司的Hiseq2000測序平臺對樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序,進一步基于Cufflinks軟件包對各轉(zhuǎn)錄本和基因的表達量進行計算,并以A549細胞為對照,依照差異倍數(shù)log2|Fold Change|≥2且FDR<0.01的標準篩選兩樣本的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs)?；贕O，COG及KEGG 3個基因功能數(shù)據(jù)庫對初步篩選得到的DEGs進行了功能注釋及信號通路富集分析,并結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)深度挖掘和臨床應用評估[7]。

1.4 AKR家族基因差異表達驗證

基于quantitivereversetranscription-PCR(qRT-PCR)技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)的差異基因AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1進行差異表達分析。采用TRIzol法提取兩組細胞總RNA。mRNA反轉(zhuǎn)錄和定量基于One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit II提供的試劑完成。所有qRT-PCR實驗均在ABI ViiA7熒光定量平臺進行, 反應程序設置為95℃, 1 min; 95℃,20 s; 60℃, 40 s, 共計40個循環(huán), 于60℃收集熒光, 并依據(jù)2Ct內(nèi)參基因-Ct待測基因計算各基因的表達量差異。特異性引物依靠primer-blast在線軟線設計完成,選取GAPDH為內(nèi)參基因,見表1。

表1 mRNA定量引物序列Tab.1 Primers sequences used for mRNA expression analysis

1.5 CCK-8法細胞活性檢測

CCK-8的主要成分是四唑鹽WST-8,其可在電子載體1-Methoxy PMS的作用下被細胞內(nèi)的脫氫酶還原為水溶性的甲臜染料(吸收峰為450nm),其生成量與培養(yǎng)孔中活細胞數(shù)量成正比,故用酶標儀檢測培養(yǎng)基的在450nm處的吸光值可間接反映出活細胞的數(shù)目。收集對數(shù)期生長的細胞,胰酶消化后完成細胞計數(shù)。根據(jù)計數(shù)情況將細胞稀釋到50 000個/mL,按每孔100μL體積將細胞懸液加入96孔板中,即每孔接種細胞數(shù)約為5 000。待細胞貼壁后將原培養(yǎng)基更換梯度濃度的含藥培養(yǎng)液。培養(yǎng)48h后棄去培養(yǎng)液,更換為含10%CCK-8的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育,2h后在酶標儀上檢測各孔細胞在450nm處的吸光值。吸光值即反映出活細胞的數(shù)目。

1.6 抑制劑阻斷實驗

本研究使用的3種抑制劑為Salicylate，Epalrestat與Medroxyprogesterone acetate,作用對象分別是AKR1C1，AKR1B1及AKR1C3。在抑制劑處理之前,為消除原培養(yǎng)基中藥物對實驗的干擾,首先移除含順鉑的培養(yǎng)基,更換無藥培養(yǎng)基對其培養(yǎng)2h。采用濃度梯度的3種抑制劑對A549/DDP進行處理,采用CCK-8法對使用抑制劑后A549/DDP細胞活性進行測定,繪制細胞生長抑制曲線并計算每種抑制劑對A549/DDP細胞的IC50。Epalrestat濃度梯度設置為0,20,30,40,50與60μmol/L;Salicylate濃度梯度設置為0,0.125,0.25,0.5,1，2mmol/L;Medroxyprogesterone acetate濃度梯度設置為0,5,10,20,40與60μmol/L。抑制劑濃度由前期預實驗摸索得到。確定3種抑制劑的IC50濃度后,分別將這3種抑制劑與順鉑聯(lián)合作用于A549/DDP細胞,順鉑的濃度梯度分別為0,2,5,10,20,40和50μmol/L,采用CCK-8法測定這3種抑制劑對A549/DDP順鉑敏感性的影響。

1.7 RNA干擾實驗

RNA干擾實驗基于Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑體系完成。本研究使用的small interference RNA(siRNA)序列見表2。轉(zhuǎn)染于96孔細胞培養(yǎng)板或6孔細胞培養(yǎng)板中完成,以scramble siRNA作為對照。轉(zhuǎn)染完成后將培養(yǎng)基更換順鉑濃度分別為0,2,5,10,20,40和50 μmol/L的含藥培養(yǎng)液,同時設置僅添加培養(yǎng)液的調(diào)零孔,培養(yǎng)48h后基于CCK-8法對細胞的活性進行測定,并計算轉(zhuǎn)染后順鉑對A549/DDP細胞的IC50。

表2 siRNA序列Tab.2 Sequences of siRNA

1.8 細胞凋亡實驗

轉(zhuǎn)染24h或48h后,分別將對照組和各實驗組的細胞制備成細胞懸液,基于Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒分析各實驗組細胞的凋亡情況,并統(tǒng)計分析各組間的差異。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標準差(means ± SD)表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05表示差異有顯著性。

2 實驗結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果最終篩選出1 214個差異表達的基因,其中656個基因在A549/DDP細胞中表達上調(diào),余下558個基因則呈現(xiàn)為下調(diào)狀態(tài)。圖1為1 214個差異表達基因的火山分布圖[7]，綠色的點代表表達量下調(diào)的基因,紅色的點代表表達量上調(diào)的基因,黑色的點代表表達量沒有差異的基因。其中，AKR1家族的3個成員AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1同時在A549/DDP細胞中顯著上調(diào),其差異倍數(shù)分別為19.97，5.00和7.03。

每個點指代一個基因,紅色點表示該基因在A549/DDP細胞中顯著上調(diào),綠色點表示該基因在A549/DDP中顯著下調(diào),黑色點表示該基因在兩種細胞中無顯著表達差異。圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

2.2 qRT-PCR證實AKR1家族3個基因在A549/DDP細胞中顯著表達上調(diào)

基于qRT-PCR技術(shù),對3個基因在兩組細胞中的表達差異情況進行了驗證。如圖2所示,轉(zhuǎn)錄組新一代測序平臺(Next Generation Sequencing,NGS)和qRT-PCR平臺的檢測結(jié)果一致。

2.3 Salicylate和Epalrestat顯著提升A549/DDP細胞對順鉑的敏感性

針對AKR1C1，AKR1B1及AKR1C3 3種酶,選取相應的抑制劑Salicylate(SA),Epalrestat(EPA)與Medroxyprogesterone acetate(MA),將它們分別作用于A549/DDP細胞。48h后對3種抑制劑對細胞的毒性分別進行檢測,發(fā)現(xiàn)SA和EPA均可顯著抑制A549/DDP細胞的活性,且有明顯的藥物的濃度依賴性。然而,不同濃度的MA均未對A549/DDP細胞的活性產(chǎn)生顯著影響(圖3)。

基于抑制率曲線,最終求得SA作用于A549/DDP細胞的IC50濃度約為0.60mmol/L,EPA為38.42μmol/L。我們進一步使用3種抑制劑分別與順鉑聯(lián)合處理A549/DDP細胞,以探索AKR1的抑制對順鉑敏感性的影響。SA，EPA和MA的作用濃度分別為:0.60，38.42，30μmol/L。結(jié)果顯示，SA使得順鉑作用的IC50由34.4μmol/L±1.77μmol/L降低至15.26±2.36μmol/L(P<0.05),EPA則使其降低至21.56 ±1.29μmol/L(P<0.05),而MA并未顯著影響A549/DDP對順鉑的敏感性(圖4A)。實驗結(jié)果表明,SA或EPA與順鉑的聯(lián)合使用顯著改善了A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。我們進一步檢測了SA或EPA增強順鉑敏感性的作用是否存在時間依賴性。結(jié)果表明，SA聯(lián)合順鉑處理24h即顯著增強了順鉑的細胞毒性(P<0.05),而EPA則在連續(xù)處理36h后才表現(xiàn)出明顯的順鉑增敏效應(P<0.05)。這表明SA和EPA均顯著提升了A549/DDP的順鉑敏感性,且呈現(xiàn)出明顯的時間依賴性(圖4B)。

A為AKR1C1抑制劑Salicylate對A549/DDP作用結(jié)果。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*vs.NS P<0.05;**vs.NS,P<0.01;***vs.NS P<0.001。B為AKR1C3抑制劑Epalrestat對A549/DDP作用結(jié)果。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*vs.DMSO, P<0.05;***vs.DMSO，P<0.001。C為AKR1B1抑制劑Medroxyprogesterone acetate對A549/DDP作用結(jié)果。圖3 AKR1抑制劑對A549/DDP的作用Fig.3 Cyto-toxicity of AKR1 inhibitors on A549/DDP cells

A為SA,EPA以及MA分別與不同濃度順鉑聯(lián)合使用對A549/DDP作用結(jié)果。SA作用濃度為0.60mM,EPA作用濃度為38.42μM,MA作用濃度為30μM。B為SA及EPA分別與順鉑聯(lián)合使用對A549/DDP細胞的抑制作用。分別于12h、24h、36h、48h以及72h對細胞活性進行檢測。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*表示P<0.05。圖4 AKR1抑制劑對順鉑敏感性的影響Fig.4 Effect of AKR1 inhibitors on DDP sensitivity

2.4 AKR1C1和AKR1C3對細胞順鉑敏感性的影響

AKR1C1和AKR1B1的酶活抑制劑顯著提升了A549/DDP細胞對順鉑的藥物敏感性,為了進一步驗證這一結(jié)果,分別設計并合成了AKR1C1和AKR1B1的siRNA,在轉(zhuǎn)錄水平對這兩個基因進行了敲減。將特異性siRNA和scramble RNA分別轉(zhuǎn)染至A549/DDP細胞中,在siRNA轉(zhuǎn)染24h及48h后,分別對敲減效率進行驗證。siRNA轉(zhuǎn)染24h或48h后,AKR1C1及AKR1B1在A549/DDP細胞中的表達量均顯著下調(diào);相較于短時間處理,48h的敲減效果更佳,其中AKR1C1的敲減效率可達90%以上,而AKR1B1的敲減效率則超過85%,因此我們選取48h作為基因敲減實驗的終點(圖5)。由于前期實驗結(jié)果未能證實AKR1C3與順鉑的耐藥相關(guān),故未進一步研究AKR1C3干擾對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響。轉(zhuǎn)染后,我們對各組細胞進行順鉑處理并在48h后進行細胞活性檢測。如圖5C所示,單獨敲減AKR1C1或AKR1B1均沒有顯著改善A549/DDP細胞的順鉑耐藥情況;然而,在A549/DDP細胞中同時敲減AKR1C1和AKR1B1則顯著提升了細胞的順鉑敏感性(P<0.05)。

2.5 AKR1C1和AKR1C3對順鉑誘導的細胞凋亡影響

基于前期實驗結(jié)果,我們在A549/DDP細胞中同時敲減AKR1C1和AKR1B1并分別在順鉑處理24h和48h后,分析實驗組和對照組細胞的凋亡情況。如圖6所示,相較于對照組細胞,同時敲減AKR1C1和AKR1B1顯著增強了順鉑誘導的A549/DDP細胞的凋亡作用(P<0.05)。

A為 AKR1C1敲減效率驗證結(jié)果;B為AKR1B1敲減效率驗證結(jié)果。結(jié)果用mean±SD表示, n=3。**vs.scramble, P<0.01;***vs.scramble, P<0.001。C為基因敲減對A549/DDP順鉑敏感性的作用。結(jié)果用mean±SD表示,n=3。*vs.與其相同順鉑處理濃度的scramble, P<0.05。圖5 AKR1基因敲減對A549/DDP細胞順鉑敏感性的影響Fig.5 Effect of AKR1 genes knock-down on DDP sensitivity

3 討 論

醛酮還原酶超家族是以NADPH為輔酶的一類可將人體細胞內(nèi)具有強突變劑作用的醛或酮等分子還原為醇的蛋白質(zhì)總稱,而AKR1基因家族是其中一個分支[8]。研究表明,AKR1家族的多個成員與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān):AKR1C1，AKR1C2和AKR1C3在肺癌[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]和乳腺癌[11]組織中均呈現(xiàn)為異常高表達;AKR1B1的高表達與乳腺癌的發(fā)展密切相關(guān)并可作為患者不良預后的分子標志物[12]。另有研究證實,AKR1C1促進NSCLC腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[13],且AKR1C3可作為區(qū)分NSCLC和SCLC的分子標志物[14]。

AKR1家族成員AKR1C1,AKR1C3及AKR1B1還被證明與抗腫瘤藥物的耐藥性相關(guān):Shiiba團隊的研究表明,AKR1C1和AKR1C3與順鉑和5-氟尿嘧啶這兩種化療藥物的耐藥性相關(guān)[15];Matsumoto R的實驗證實通過炎性細胞因子interleukin-1β下調(diào)AKR1C1基因的表達,使得膀胱癌細胞的耐藥性大大降低[16];而Matsunaga T的實驗結(jié)果則證實,基于siRNA技術(shù),下調(diào)AKR1C1表達同樣顯著提高了結(jié)直腸癌細胞HCT-15對順鉑的藥物敏感性[17];此外,Sonowal H團隊的實驗表明,抑制AKR1B1酶活性可增強結(jié)腸癌細胞對阿霉素的敏感性[18]。這些研究結(jié)果均提示了,AKR1家族的部分成員與多種腫瘤化療藥物的敏感性相關(guān),這與本課題組前期的研究結(jié)果相同。

在課題組前期的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中,AKR1家族的3個基因AKR1C1，AKR1C3及AKR1B1在肺腺癌耐藥細胞株中表達量顯著上調(diào),這一結(jié)果揭示了這3個基因可能與肺腺癌A549細胞的順鉑耐藥有著緊密的關(guān)聯(lián)。但是，目前尚缺少系統(tǒng)性的研究證實該家族的基因在非小細胞肺癌順鉑獲得性耐藥中的作用。同時,目前沒有任何專注于AKR1抑制劑在修復順鉑敏感性,即探索將AKR1抑制劑應用于順鉑耐受的非小細胞肺癌患者臨床治療中的報道。所以，本研究就這3個基因是否能加強肺腺癌耐藥細胞的順鉑敏感性做了進一步的研究和探索。

我們基于抑制劑阻斷和RNAi技術(shù),對AKR1家族基因AKR1C1，AKR1B1和AKR1C3進行了功能性驗證。抑制劑實驗結(jié)果表明,AKR1C1或AKR1B1酶活抑制劑與順鉑聯(lián)合使用可顯著提高A549/DDP細胞的順鉑敏感性;而抑制AKR1C3酶活性并不能引起肺腺癌耐藥細胞A549/DDP對順鉑的敏感性增強。究其原因可能有以下兩點:第一,AKR1C3的表達上調(diào)與順鉑耐藥無關(guān),而是“被動”受其他信號因子調(diào)控的結(jié)果,這與腫瘤發(fā)生中產(chǎn)生的‘passive mutation’情況相似,即AKR1C3并非調(diào)控順鉑敏感性的關(guān)鍵因子;第二,AKR1家族成員之間或與其他家族的藥物代謝酶間存在功能上的重疊現(xiàn)象,可在一定程度上彌補抑制劑造成的功能阻斷。敲減實驗結(jié)果表明:在A549/DDP細胞中同時敲減AKR1C1和AKR1B1不僅增強了順鉑的細胞毒性,且同時顯著增強了順鉑誘導的細胞凋亡作用。同時，敲減AKR1C1和AKR1B1可顯著提高細胞對順鉑的敏感性,但單獨敲減二者之一則沒有明顯的作用,即從側(cè)面證實了AKR1家族成員之間存在的功能重疊現(xiàn)象。同時也表明,AKR1C1與AKR1B1都在調(diào)節(jié)A549細胞順鉑耐藥中起到關(guān)鍵作用。

綜上所述,本研究的實驗結(jié)果進一步地證實了AKR1C1與AKR1B1基因在調(diào)節(jié)A549細胞順鉑耐藥中起到了關(guān)鍵作用。本階段的研究成果為解決肺腺癌臨床治療中出現(xiàn)的順鉑耐藥問題提供了解決思路,并為肺腺癌的臨床精準醫(yī)療提供了新的潛在分子靶標,同時本研究成果也為其他惡性腫瘤的治療提供了理論支持。