高少勇，金詠絮，連寧芳，林其昌，陳公平

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以不完全可逆及持續(xù)進展的氣流受限為特征的全身慢性炎癥性疾病，糖皮質(zhì)激素在治療該疾病中的應(yīng)用一直是臨床關(guān)注的熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象，原因可能與組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 2，HDAC-2)的表達(dá)下降有關(guān)[2-3]。已有文獻報道，在COPD患者中，小劑量茶堿能減輕炎癥反應(yīng)，紅霉素具有抗炎作用[4]。本研究以SD大鼠為基礎(chǔ)構(gòu)建COPD大鼠模型，探討茶堿聯(lián)合紅霉素治療COPD的效果以及對HDAC-2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級雄性SD大鼠[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司(許可證號：HLK0305)]50只，體質(zhì)量(270±15)g(250～350 g)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2主要試劑 紅霉素(國藥準(zhǔn)字H42021990，宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)；茶堿緩釋片(國藥準(zhǔn)字H44023791，廣州邁特興華制藥廠有限公司)；DAB顯色試劑盒、通用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒(上海銘博生物科技有限公司)；兔抗大鼠HDAC-2多克隆抗體(美國BioVision公司)；白細(xì)胞介素-8(interleukin-8，IL-8)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)檢測試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?；其他試劑均為分析純國產(chǎn)試劑。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺(AIRTECH，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；臺式低溫高速冷凍離心機(太倉市醫(yī)療械廠)；紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠)；全自動生化分析儀(iChem-530，深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司)；電泳儀(上海第三分析儀器廠)；電子天平(BS223S型，北京賽多利斯儀器系列有限公司)；石蠟切片機(上海仙申醫(yī)教儀器廠)。

1.2方法

1.2.1動物分組 取雄性SD大鼠50只，隨機分為正常組(n=10)和COPD組(n=40)，COPD組再采用隨機數(shù)字表法分為4組，對照組、紅霉素組、茶堿組及紅霉素+茶堿組，每組各10只。

1.2.2構(gòu)建COPD大鼠動物模型 取40只大鼠，于第1天和第14天腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛(3 mg/kg)麻醉大鼠，經(jīng)口氣管插管后滴入0.2 mL(1 g/L)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。第2～13天和第15～30天，放入自制玻璃熏煙箱中被動吸煙，1支/只，持續(xù)約0.5 h，每日2次，2次至少間隔6 h。具體方法：將點燃的香煙煙霧通過自制三通管抽吸到50 mL注射器中，關(guān)閉吸煙通路一端，打開注射器與熏煙箱連接的通路端，將煙霧注入熏煙箱，使大鼠被動吸煙。香煙(紅七匹狼)焦油含量12 mg，煙堿量1.1 mg。正常組(n=10)給予0.2 mL生理鹽水和新鮮空氣處理。

1.2.3給藥方法 第31天，將COPD大鼠隨機分為對照組、紅霉素組、茶堿組、紅霉素+茶堿組，每組10只。對照組予生理鹽水灌胃，每日1次，每次2 mL；紅霉素組予紅霉素(配置成1.25%的紅霉素口服液，現(xiàn)配現(xiàn)用)灌胃(100 mg/kg)，每日1次；茶堿組予氨茶堿灌胃(80 mg/kg)，每日1次；紅霉素+茶堿組將上述濃度的紅霉素及氨茶堿灌胃。各組給藥時間均為30 d。

1.2.4標(biāo)本取材 第61天，將各組大鼠麻醉，以5 mL一次性注射器行心臟穿刺取血，留取5 mL全血，靜置20 min，3 000 r/min離心15 min，將血清分裝于2 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱中待測。結(jié)扎右主支氣管，于隆突上用套管針穿刺至左肺，以2 mL生理鹽水灌洗左肺，再緩慢回抽，每次回收液體約1.5 mL，如此反復(fù)灌洗3次，回收率約75%，再次離心，取上清液放置于-80 ℃冰箱中。留取一側(cè)肺葉，置于50倍體積的4%多聚甲醛中固定6 h，石蠟包埋、切片，準(zhǔn)備進行H-E染色和免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5檢測方法 按照說明書步驟進行酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清及肺泡灌洗液中的IL-8及TNF-α水平，并將大鼠的肺組織進行H-E染色，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺組織中HDAC-2表達(dá)，采用圖像分析系統(tǒng)測定大鼠肺組織中的HDAC-2的陽性系數(shù)。每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，采用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，檢測每個高倍鏡視野下陽性細(xì)胞的平均吸光度值，取平均值作為陽性表達(dá)的相對強度，對比各組指標(biāo)間的差異。

2 結(jié) 果

2.1血清及肺泡液IL-8及TNF-α水平 與正常組比較，對照組大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均顯著上升(P<0.05)；經(jīng)紅霉素和茶堿分別處理后，大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均顯著下降(P<0.05)；紅霉素+茶堿組大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平均顯著低于紅霉素組和茶堿組(P<0.05)，具體見表1。

表1 各組大鼠血清及肺泡液中的IL-8及TNF-α水平比較Tab 1 Comparison of serum and alveolar fluid IL-8 and TNF-α levels in each group ng/L

n=10.IL-8:白細(xì)胞介素8；TNF-α：腫瘤壞死因子α.與對照組比較，△：P<0.05；與紅霉素組比較，▲：P<0.05；與茶堿組比較，★：P<0.05.

2.2組織學(xué)表現(xiàn)特點 正常組大鼠的肺泡及氣管上皮結(jié)構(gòu)完整，無肺泡破裂、融合，肺間質(zhì)無炎性細(xì)胞浸潤、水腫，肺泡間隔無增厚。對照組大鼠的肺間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤、水腫，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂、融合形成肺大泡。與對照組比較，紅霉素組和茶堿組支氣管黏膜的增厚程度、炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。紅霉素+茶堿組平滑肌細(xì)胞、基底細(xì)胞排列相對規(guī)則，炎癥細(xì)胞浸潤程度較輕，與正常組大鼠的支氣管肺組織差別不大(圖1)。

2.3HDAC-2表達(dá)情況 與正常組(92.53±9.32)比較，對照組大鼠肺組織的HDAC-2表達(dá)水平(17.56±1.35)顯著降低(P<0.05)；與對照組比較，紅霉素組和茶堿組大鼠肺組織的HDAC-2表達(dá)水平(33.56±2.85)，(39.65±3.15)均顯著上升(P<0.05)；紅霉素+茶堿組大鼠肺組織的HDAC-2表達(dá)水平(68.75±5.31)均顯著高于紅霉素組和茶堿組(P<0.05，圖2)。

A：正常組，肺泡及氣管上皮結(jié)構(gòu)完整，無肺泡破裂、融合；B：對照組，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂、融合形成肺大泡；C：紅霉素組，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減輕；D：茶堿組，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕；E：紅霉素+茶堿組，基底細(xì)胞排列相對規(guī)則，肺泡破壞程度減輕.圖1 各組大鼠肺組織組織學(xué)表現(xiàn)特點(H-E ×100)Fig 1 H-E staining results of lung tissue of each group of rats (H-E ×100)

HDAC-2：組蛋白去乙酰化酶2.A：正常組，HDAC-2高表達(dá)；B：對照組，HDAC-2低表達(dá)；C～E：分別為紅霉素組、茶堿組及紅霉素+茶堿組，均表現(xiàn)為HDAC-2表達(dá)上升.圖2 各組大鼠肺組織HDAC-2免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(×400)Fig 2 HDAC-2 immunohistochemistry results of lung tissue of each group(×400)

3 討 論

COPD是一種以氣流阻塞為臨床特征的慢性氣道炎癥性疾病，其主要發(fā)病因素是吸煙，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，90%以上的COPD與吸煙相關(guān)[5]，因此，被動吸煙是構(gòu)建COPD動物模型的經(jīng)典方法。目前，已有學(xué)者采用氣道內(nèi)2次滴入脂多糖聯(lián)合被動吸煙的方法構(gòu)建大鼠COPD模型[6]。本研究參照該方法進行，結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織病理發(fā)生明顯改變，與人類COPD的病理改變一致，表明COPD大鼠模型構(gòu)建成功。

目前認(rèn)為，慢性炎癥在COPD的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與肺組織和氣道結(jié)構(gòu)的損傷和重構(gòu)過程，導(dǎo)致氣流受限，發(fā)生不完全可逆的進展[7]。IL-8是中性粒細(xì)胞趨化因子，而TNF-α是一種強效的促炎癥因子，二者均可以促進細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的釋放，被證實參與了COPD的發(fā)生與發(fā)展過程，在COPD的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[8-10]。本研究結(jié)果顯示，在COPD的發(fā)病過程中，IL-8和TNF-α表現(xiàn)為較高表達(dá)。

研究證實，紅霉素長期用于治療COPD，可顯著降低COPD患者急性加重次數(shù)及痰液中炎癥因子IL-8水平[11]。茶堿類藥物具有提高氣道平滑肌細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度、從而抑制磷酸二酯酶的作用，在治療COPD中效果明顯，可通過抑制腺苷受體拮抗腺苷而抑制核因子(NF)-κB的轉(zhuǎn)錄，最終降低炎癥因子的水平[12]。本研究中，單獨應(yīng)用紅霉素或茶堿后，COPD大鼠血清及肺泡液中的IL-8和TNF-α水平明顯降低，聯(lián)合應(yīng)用紅霉素和茶堿后進一步降低。表明二者聯(lián)合應(yīng)用治療效果更佳，可有效減輕炎癥反應(yīng)，這與臨床的試驗結(jié)果一致[13]。

目前，糖皮質(zhì)激素是治療COPD最主要的藥物，也是最有效的抗炎藥物之一。臨床研究證實，小劑量糖皮質(zhì)激素可幫助減輕氣道炎癥，緩解哮喘患者的癥狀，但糖皮質(zhì)激素對多數(shù)COPD患者的治療效果并不理想，易發(fā)生糖皮質(zhì)激素抵抗[14]。糖皮質(zhì)激素抵抗的機制目前尚不明確，可能的機制包括絲裂原活化蛋白激酶通路被細(xì)胞因子激活、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子增加、轉(zhuǎn)錄因子激活通路缺乏、P-糖蛋白介導(dǎo)的藥物外排增加、HDAC-2的表達(dá)降低等[15]。研究表明，COPD患者中HDAC-2的表達(dá)及活性降低與糖皮質(zhì)激素抵抗密切相關(guān)，其對激活的炎性基因去乙?；饔媒档停瑢?dǎo)致無法阻斷炎性基因的轉(zhuǎn)錄，從而減弱糖皮質(zhì)激素的抗炎作用，可能是該類患者發(fā)生糖皮質(zhì)激素抵抗的重要途徑[16]。當(dāng)發(fā)生糖皮質(zhì)激素抵抗時，尋求有效的改善方法在臨床應(yīng)用中是十分必要的。研究顯示，紅霉素可通過上調(diào)HDAC-2蛋白的表達(dá)減輕氧化應(yīng)激下THP-1細(xì)胞的糖皮質(zhì)激素抵抗[17]。氨茶堿能夠改善COPD大鼠的肺功能，肺組織的HDAC活性和HDAC-2蛋白表達(dá)增高，而肺組織中IL-8水平降低[18]。然而，該研究也發(fā)現(xiàn)，氨茶堿并不能在轉(zhuǎn)錄水平上影響HDAC-2，但卻可以增加其蛋白的表達(dá)，具體分子學(xué)機制尚不明確。本研究結(jié)果表明，紅霉素或茶堿均有助于改善COPD大鼠的炎癥反應(yīng)，聯(lián)合應(yīng)用效果更好，可以上調(diào)HDAC-2表達(dá)，推測聯(lián)合應(yīng)用2種藥物可能可以改善COPD大鼠糖皮質(zhì)激素抵抗。

綜上所述，紅霉素和茶堿均可有效減輕COPD大鼠的炎癥反應(yīng)，并上調(diào)肺組織的HDAC-2表達(dá)水平，且二者聯(lián)合應(yīng)用效果更好，但具體的分子機制有待進一步研究。