過氧化氫酶單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙相關(guān)性的研究

劉 俊，楊 勝，羅明江，陶 娜，趙 訓(xùn)，張元梅

體內(nèi)抗氧化酶是機體抗氧化損傷的重要屏障，抗氧化酶基因的多態(tài)性可能與該酶的活性及轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)，從而影響個體間對疾病的易感性不同[1]。大量研究表明，抗氧化酶基因的多態(tài)性與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病，如心血管疾病、癌癥、糖尿病和阿爾茨海默病密切相關(guān)[2-3]。研究表明，氧化應(yīng)激在燃煤型氟中毒所致氟斑牙的發(fā)生過程中可能起重要作用[4]，而個體對氟的敏感性或耐受性存在差異，提示氟中毒可能存在遺傳易感性[5-6]，但有關(guān)抗氧化基因多態(tài)性與氟中毒的研究較少。過氧化氫酶(catalase，CAT)是一種內(nèi)源性抗氧化酶，將過氧化氫分解成水和氧氣，在控制細胞中的過氧化氫濃度中起主要作用，可以保護細胞免受氧化應(yīng)激[7]。過氧化氫酶與其他抗氧化酶一起使用，在抗氧化應(yīng)激的主要防御中發(fā)揮著不可或缺的作用。研究報道，編碼過氧化氫酶基因的功能多態(tài)性將影響酶的活性，導(dǎo)致羥基自由基形成增加和疾病風(fēng)險增加[8]。因此，本研究旨在通過病例對照研究方法探討CAT基因單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙之間的關(guān)系，為氟中毒的精確預(yù)防提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1對象 在貴州省氟中毒重病區(qū)織金縣收集氟斑牙患者195例，男性93例，女性102例，年齡(49.8±12.7)歲(21～78歲)，尿氟(1.87±1.24)mg/L,鈣攝入量(507.18±280.90)mg/d。氟斑牙的診斷根據(jù)《氟斑牙診斷標(biāo)準(zhǔn)》(WS/T208-2011)，并結(jié)合流行病學(xué)和臨床表現(xiàn)癥狀，由氟斑牙專家做出診斷。排除各種齲齒及四環(huán)素牙等其他牙齒疾病，排除中風(fēng)、腫瘤、肝硬化等重要疾病及認知或精神異常者。同時收集健康對照組195例，男性80例，女性115例，年齡(46.7±14.4)歲(21～76歲)，尿氟(1.38±1.24)mg/L,鈣攝入量(556.96±313.43)mg/d。納入標(biāo)準(zhǔn)：在招募地居住≥10年，年齡>20歲；排除標(biāo)準(zhǔn)同病例組。本研究經(jīng)單位倫理委員會批準(zhǔn)同意實施。

1.2方法

1.2.1現(xiàn)場調(diào)查 由經(jīng)過專門培訓(xùn)的調(diào)查員面對面詢問完成，調(diào)查內(nèi)容由4部分組成，即一般人口學(xué)資料、生活方式、氟中毒相關(guān)情況以及膳食調(diào)查。

1.2.2基因組分型 采用EDTA抗凝管收集研究對象的外周靜脈血5 mL，-70 ℃保存?zhèn)溆?。采用全血基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA。基因分型采用高通量TaqMan-MGB實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進行檢測，儀器為實時熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler480 Software，瑞士羅氏公司)。所有試驗由上海生物工程股份有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 經(jīng)檢驗，健康對照組中CAT rs769217和rs2300182兩個位點的基因型頻率分布符合Hardy-Weinbery平衡定律(P>0.05)。病例組的rs769217和rs2300182位點基因型CC、CT和TT分布頻率與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此外，2組間在年齡、民族、文化程度、尿氟水平、烘烤糧食、爐灶改良、使用燃料的類型等方面存在明顯差異(P<0.05，表1)。

表1 研究對象的一般情況Tab 1 The characteristics of participants

表中對照組及病例組數(shù)據(jù)為n(%).

2.2CAT基因不同遺傳模式與氟斑牙的關(guān)系 將rs769217和rs2300182位點基因型分成共顯性、超顯性、顯性、隱性和累加模式5種不同的遺傳模式，單因素分析未發(fā)現(xiàn)CAT rs769217及rs2300182位點不同遺傳模式與氟斑牙有關(guān)，校正性別、年齡、婚姻狀況、民族、文化程度、飲酒、吸煙、飲茶、使用燃料種類、改良爐灶、烘烤糧食及鈣攝入水平后，仍未發(fā)現(xiàn)2個位點與氟斑牙存在關(guān)聯(lián)(表2)。

表2 CAT單核苷酸多態(tài)性在病例組與對照組的分布情況及風(fēng)險估計Tab 2 The distribution of genotype frequency and odds ratio of dental fluorosis CAT SNP

表中對照組及病例組的數(shù)據(jù)為n(%).a：未校正的OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食及鈣攝入水平.

2.3CAT單核苷酸多態(tài)性與環(huán)境交互作用 將研究對象按性別、吸煙、民族和鈣攝入水平進行分層并做交互作用分析，多因素Logistic回歸發(fā)現(xiàn)，在鈣攝入較多時(>482 mg/d)，rs769217位點AT+TT基因攜帶者相對于AA基因型攜帶者氟斑牙明顯降低，而鈣攝入較少時(<482 mg/d)，該保護作用消失。交互作用分析發(fā)現(xiàn)，rs769217位點基因多態(tài)性與膳食鈣的攝入水平存在交互作用(P交互作用<0.05)，OR以及95%CI為0.79(0.63，0.95)，具體見表3～4。

表3 rs2300182位點單核苷酸多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析Tab 3 The interaction between rs2300182 SNP and environment factors

表中對照組及病例組的數(shù)據(jù)為n(%).a：未校正的OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食及鈣攝入水平.

3 討 論

CAT是一種抗氧化酶，其活性對于防止由活性氧引起的損傷至關(guān)重要。人類的CAT基因位于染色體11 p13，全長約37 kb，由12個內(nèi)含子和13個外顯子組成。CAT基因多態(tài)性可能與CAT的活性有關(guān)，從而影響不同個體對疾病的易感性[8]。Suzen等研究表明，CAT基因多態(tài)性引起不同個體的CAT表達差異，導(dǎo)致機體對活性氧的敏感性不同，這可能引起體內(nèi)羥基自由基增多從而增加疾病風(fēng)險[9]。氧化應(yīng)激是燃煤型地方病氟中毒的重要機制，目前關(guān)于CAT基因多態(tài)性氟中毒的關(guān)聯(lián)研究較少。涂茜等應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片段長度多態(tài)性分析方法，研究CAT基因啟動子區(qū)-262C/T、-21A/T多態(tài)性與燃煤型氟中毒之間的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)改灶干預(yù)組、非干預(yù)組和對照組中CAT基因型頻率及等位基因頻率分布無明顯差異[10]。本研究也發(fā)現(xiàn)，rs2300182和rs769217兩個位點的單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙風(fēng)險無明顯關(guān)聯(lián)。原因可能是，氟斑牙是一種較復(fù)雜的地球化學(xué)性疾病，可能是遺傳因素與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，CAT基因與環(huán)境因素存在交互作用，導(dǎo)致其效應(yīng)被掩蓋。

本研究探討年齡、性別、民族、吸煙及鈣攝入量等因素與CAT基因兩個位點的交互作用，發(fā)現(xiàn)膳食鈣的攝入水平與CAT rs2300182位點單核苷酸多態(tài)性存在交互作用，提示膳食鈣在CAT rs2300182位點不同基因型中對氟斑牙的作用有所區(qū)別。研究已證明，基因與飲食相互作用可能影響疾病風(fēng)險[11-13]。Takeshige等研究發(fā)現(xiàn)，維生素D受體基因多態(tài)性可能與日本患結(jié)直腸癌的風(fēng)險降低是否有關(guān)取決于膳食鈣的攝入量[11]。Larsen等分析了54個單核苷酸多態(tài)性與肥胖相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)增加鈣可降低易肥胖人群的腰圍水平[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣攝入水平較高的AT+TT基因攜帶者發(fā)生氟斑牙的風(fēng)險明顯低于AA型攜帶者。該結(jié)果表明，通過補鈣預(yù)防氟斑牙可能只對AT+TT基因型攜帶者有用。徐輝等發(fā)現(xiàn)，低鈣時自由基含量及腎組織細胞內(nèi)活性氧明顯升高，CAT的活性在低鈣也明顯降低，因此膳食鈣及CAT的交互作用可影響氧化應(yīng)激水平，從而修飾CAT與氟斑牙風(fēng)險的關(guān)聯(lián)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CAT基因與氟中毒無關(guān)聯(lián)可能被膳食營養(yǎng)等環(huán)境因素掩蓋。然而，其潛在的生物學(xué)機制仍有待闡明。

綜上所述，CAT rs769217位點單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙的風(fēng)險之間無明顯關(guān)聯(lián)，而CAT rs2300182位點單核苷酸多態(tài)性與氟斑牙風(fēng)險降低有關(guān)，但取決于鈣的攝入量。本研究招募的對象來自鄉(xiāng)村居民，均為當(dāng)?shù)鼐幼?0年以上的成年人，但因為年輕男性多外出務(wù)工，本研究納入的多為中老年女性。因此本研究存在一定的選擇偏倚。但本研究分層分析未發(fā)現(xiàn)CAT rs769217及rs2300182位點與氟斑牙的關(guān)系受性別和年齡的影響。本研究結(jié)果提示，補鈣預(yù)防氟斑牙可能只對AT+TT基因型攜帶者有用，因此通過補鈣預(yù)防氟中毒需要個體化，為探索地方性氟中毒精準(zhǔn)預(yù)防及干預(yù)提供了理論依據(jù)和參考。

表4 rs769217位點單核苷酸多態(tài)性與環(huán)境的交互作用分析Tab 4 The interaction between rs769217 SNP and environment facors

表中對照組及病例組的數(shù)據(jù)為n(%).a：未校正的OR；b：校正年齡、性別、民族、婚姻狀況、文化程度、吸煙、飲酒、飲茶、改良爐灶、使用燃料種類、烘烤糧食及鈣攝入水平.