楊先碧

自古以來，人類的好奇心不斷地推動著社會進步。在好奇心的驅(qū)使下，人類不僅把目光投向數(shù)萬光年之外的星空，也把視野推進到微納尺寸的微觀世界。對生命的細節(jié)看得越仔細，就越有利于人們知曉生命的本質(zhì)。正是在這樣的背景下，顯微技術成為熱門的科研領域，相關科學家也多次榮獲諾貝爾獎。瑞士科學家雅克·杜波謝、美國科學家阿希姆·弗蘭克、英國科學家理查德·亨德森，也因在冷凍顯微電鏡領域的突出貢獻，而分享了2017年諾貝爾化學獎。

顯微鏡放大微小樣品

如何看清微觀世界里的小東西？我們首先想到的就是使用顯微鏡。原始的光學顯微鏡是一個高倍率的放大鏡。據(jù)記載，在1610年前，意大利物理學家伽利略己制作過復式顯微鏡，并觀察了昆蟲的復眼。這是一種己具目鏡、物鏡和鏡簡等裝置，并被固定在支架上的顯微鏡。

1665年前后，英國生物學家胡克發(fā)明了比較類似我們現(xiàn)在學校實驗室里用的顯微鏡，并通過這臺顯微鏡看到了軟木中網(wǎng)格狀的結構，胡克稱之為“細胞”。這是人類歷史上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，大大推動了生物學的發(fā)展。

與胡克同時代的荷蘭科學家列文虎克對顯微技術的推動做出了主要貢獻。他一生制作了不少于247架顯微鏡，觀察了許多細菌、原生動物和動植物組織，是第一個用顯微鏡做科學觀察的人。到18世紀，顯微鏡已有許多改進，應用比較普遍，已作為一種商品進行生產(chǎn)。

然而，傳統(tǒng)的光學顯微鏡不能無限制地放大微小的樣品，它會受到“阿貝原則”的限制。什么是“阿貝原則”？1873年，德國顯微鏡學家恩斯特·阿貝通過計算發(fā)現(xiàn)，由于光波相互干擾的原因，光學顯微鏡不能無限度地放大微小樣品，最多只能“看到”光波波長一半的樣品，即尺寸不小于200納米的樣品。這就是有名的“阿貝原則”，200納米也被稱為光學顯微鏡的“繞射極限”。

如何看清生物大分子

光學顯微鏡只能看到細胞或細胞內(nèi)較大的細胞器，要看到100納米以下的生物大分子就不太可能了。生物大分子是指生物體細胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)、核酸、多糖等大分子。每個生物大分子內(nèi)有幾千到幾十萬個原子，分子量從幾萬到幾百萬以上。生物大分子的結構很復雜，但其基本的結構單元并不復雜。蛋白質(zhì)分子是由氨基酸分子以一定的順序排列成的長鏈。氨基酸分子是大部分生命物質(zhì)的組成材料，不同的氨基酸分子有好幾十種。生物體內(nèi)的絕大多數(shù)酶就屬于蛋白質(zhì)，是生物體維持正常代謝功能所不可缺少的。

為了突破光學顯微鏡的局限，弄清楚生物大分子的構造，科學家想了很多辦法。有的科學家制造出超高分辨率光學顯微鏡，其實是讓生物分子發(fā)熒光，這種方法的使用有一些局限性。因為它是用激光來激發(fā)生物大分子，這樣照射時間不能太長，否則可能殺死生物大分子。但是，照射時間短又可能會失去一些重要信息。而且，超高分辨率光學顯微鏡最高只能達到10納米的分辨率，仍然無法看清分子內(nèi)部的精細結構。

還有一種很常用的方法是“x射線晶體衍射”技術。之前，亨德森就非常喜歡用這種技術來研究生物大分子。但是，這種技術也有很明顯的局限性，那就是這種方法需要首先獲取純度很高的生物大分子晶體。而不少生物大分子結晶情況不理想，甚至有的就不能結晶。膜蛋白就是一個很大的挑戰(zhàn)。對于大多數(shù)的生物，膜蛋白占了蛋白質(zhì)組的20%～30%，藥物靶點的達到40%以上。然而，這些分子的結構很少能通過X射線晶體學來闡明。

科學家還想到的方法是用電子顯微鏡（簡稱電鏡）。電鏡的分辨率的確很高，可以達到納米級以下，看清生物大分子是沒啥問題了。電子的波長是光子波長的十萬分之一左右，就像一根極細的探針，理論上它打在蛋白質(zhì)分子等生物大分子身上能被反射，這些反射的電子就能產(chǎn)生一張照片，這就是電鏡的基本原理。這也是電鏡能比光學顯微鏡分辨率高得多的原因。

起初，電鏡是在材料科學領域中使用的，主要是用其高分辨率來解析材料的結構。電鏡在材料科學上的應用遙遙領先于在生命科學上的應用。直到1947～1961年，生物學家才借鑒材料科學中的重金屬染色技術，利用電鏡技術觀測到了許多細胞亞顯微結構，如葉綠體、線粒體、核糖體，等等。然而，電鏡的局限性也很明顯，那就是不能看到活生生的生物大分子。因為電鏡需要在高真空條件下工作，而生物樣品的含水量很高，水分的揮發(fā)使整個樣品無法保持真空。另外，電鏡的電子攜帶的能量很高，會把細胞“殘忍地燒死”。這樣一來，生物學家就難以研究分子在活細胞中的正?；顒印?p>

速凍凝固生命細節(jié)

為了讓電鏡也能看到活細胞內(nèi)的生物分子，科學家想了很多辦法。最終想到的辦法就是速凍。這就好比科幻小說中的冷凍休眠，把活人速凍之后，人體組織和細胞進入幾乎沒有活動的休眠狀態(tài)。多年以后，采用合理的方法解凍，人體又活過來了。也就是說，速凍的細胞雖然幾乎不能活動，但是它們的的確確具有生物活性。

在冷凍電鏡中，生物大分子被迅速冷凍，使得標本內(nèi)部和周圍的水被固定為玻璃態(tài)，以防止晶體的形成。玻璃態(tài)——一種看上去是固體，但其分子排列是無序的形態(tài)，所以是不折不扣的流體。為什么是玻璃態(tài)而不是冰（晶體）呢？首先，是為了保護生物大分子，凍成冰有可能讓生物大分子發(fā)生脫水，冰晶也容易傷害生物。其次，冰會衍射電子，從而降低電鏡觀察的圖像質(zhì)量。