NAA、6-BA 和KT 對(duì)煙草葉片不定芽和不定根分化的影響

張凌云 孫 娟 劉艷秋

（首都師范大學(xué)附屬回龍觀育新學(xué)校 北京 102208）

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害防治和保健等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值［1-2］。 此外，煙草常被作為植物基因工程和分子生物學(xué)研究中重要的模式植物。 通過(guò)對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化探究基因的功能及作用機(jī)理［3-4］，解析次生代謝產(chǎn)物的合成機(jī)制［5］等，其中煙草組織培養(yǎng)技術(shù)是上述研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 有關(guān)萘乙酸（NAA）和6-芐基氨基嘌呤（6-BA）誘導(dǎo)不同種植物組織分化出根和芽的研究較多［6-8］，而不同濃度的NAA、6-BA 和激動(dòng)素（KT）對(duì)煙草離體葉片不定器官分化的研究較少。 詹虹等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基中添加0.5 mg／L NAA 和0.5 mg／L 6-BA， 煙草葉片的出芽率為100%；MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg／L NAA 和0.1 mg／L 6-BA， 葉片的出芽率為0。 李玉明等［10］研究發(fā)現(xiàn)，NAA 和6-BA濃度比為5∶1 時(shí)，可誘導(dǎo)煙草葉片生成不定根；兩者的濃度比為1∶5 時(shí)，可誘導(dǎo)葉片生成不定芽。 本實(shí)驗(yàn)以普通煙草品種Wisconsin 38 為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)設(shè)計(jì)不同濃度、 不同比例的NAA、6-BA 和KT，研究它們對(duì)煙草離體葉片不定器官分化的影響，并篩選獲得適宜不定芽和不定根分化的培養(yǎng)基。研究結(jié)果為煙草的組織培養(yǎng)及煙草基因工程提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料 普通煙草品種Wisconsin 38（W38）的種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院特用作物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 煙草無(wú)菌苗的獲得 將普通煙草品種W38 的種子用2%次氯酸鈉表面消毒5 min，無(wú)菌水漂洗2～3 次后，接種于MS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為（25±2）℃，每日16 h、2 200 lx 光照。

1.2.2 培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)及配制 以MS 為基本培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)基的組成見(jiàn)表1，所有培養(yǎng)基中均添加30%蔗糖和0.8%的瓊脂。

表1 不同培養(yǎng)基的組成

1.2.3 煙草葉片不定芽和不定根的誘導(dǎo)與分化取生長(zhǎng)30～40 天無(wú)菌煙草植株中上部的葉片，去除主脈和葉緣，切成1 cm2大小的葉盤(pán)，接種于不同組合的培養(yǎng)基（表1）中，在（25±2）℃，每日16 h、2 200 lx 光照條件下培養(yǎng)。每個(gè)處理為30 個(gè)外植體，2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每周觀察、照相記錄。培養(yǎng)5 周后，統(tǒng)計(jì)出芽率和生根率。 根據(jù)2 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算平均出芽率和生根率。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草葉片不定芽分化適宜培養(yǎng)基的獲得煙草葉片接種培養(yǎng)于1～12 號(hào)培養(yǎng)基中， 葉片切口處均能形成愈傷組織（圖1、圖2）。 培養(yǎng)3 周后，葉片在1～5 號(hào)培養(yǎng)基上形成不定芽，其中1 號(hào)最多，2號(hào)次之，6～12 號(hào)培養(yǎng)基中的葉片沒(méi)有不定芽的形 成。 3～5 周 后，1 號(hào)、2 號(hào)、4 號(hào) 和5 號(hào) 培 養(yǎng) 基中的葉片全部有不定芽的形成， 其中1 號(hào)和2 號(hào)中每個(gè)葉片平均出芽數(shù)均大于15 個(gè)芽，2 號(hào)培養(yǎng)基中不定芽生長(zhǎng)迅速，已形成較大的葉片（圖1、圖2、表2）。因此，在MS 培養(yǎng)基中添加0.1 mg／L NAA 和0.25 mg／L 6-BA 的2 號(hào)培養(yǎng)基為適宜煙草離體葉片不定芽分化的培養(yǎng)基。

2.2 煙草葉片不定根分化適宜培養(yǎng)基的獲得由圖1 和圖2 可以看出，培養(yǎng)3 周后，3 號(hào)、6 號(hào)、9 號(hào)、11 號(hào)和12 號(hào)培養(yǎng)基中的葉片有不定根的形成，其中12 號(hào)最多，11 號(hào)次之，其他培養(yǎng)基中的葉片沒(méi)有不定根的形成。 3～5 周后，9 號(hào)、11 號(hào)和12 號(hào)培養(yǎng)基中的葉片全部有不定根的形成， 其中12 號(hào)培養(yǎng)基中每個(gè)葉片的出根數(shù)最多，9 號(hào)次之（圖1、圖2、表2）。 因此，12 號(hào)培養(yǎng)基為煙草離體葉片不定根分化適宜的培養(yǎng)基，即在MS 培養(yǎng)基中添加1.0 mg／L NAA 和0.1 mg／L KT。

2.3 不同濃度NAA、6-BA 和KT 對(duì)煙草葉片不定器官分化的影響 在含有0.1 mg／L NAA 的1～6 號(hào)培養(yǎng)基中， 煙草離體葉片出芽率普遍高于其他培養(yǎng)基（表2）。 其中，6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為10∶1 和5∶2 時(shí)，出芽率均為100%。 隨著6-BA 或KT 濃度的降低，出芽率降低，而生根率增加。其中，離體葉片在添加0.1 mg／L KT 培養(yǎng)基（6 號(hào)）中的出芽率顯著低于在添加相應(yīng)濃度6-BA 培養(yǎng)基（3 號(hào)）中的出芽率。 由此可知，6-BA比KT 更易于誘導(dǎo)葉片不定芽。

在含有1.0 mg／L NAA 的7～12 號(hào)培養(yǎng)基中，離體葉片生根率普遍高于其他培養(yǎng)基（表2）。 其中，6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為1∶10 時(shí)，生根率均為100%， 隨著6-BA 或KT 濃度的升高，生根率降低，而出芽率增加。 其中，離體葉片在添加1.0 mg／L 6-BA 培養(yǎng)基（7 號(hào)）中的生根率為0，顯著低于在添加相應(yīng)濃度KT 培養(yǎng)基（10 號(hào)）中的生根率。結(jié)果顯示，較高濃度的6-BA 能影響不定根的分化。

圖1 煙草葉片在添加0.1 mg／L NAA 和不同濃度6-BA 或KT 的MS 培養(yǎng)基中的分化情況

圖2 煙草葉片在添加1.0 mg／L NAA 和不同濃度6-BA 或KT 的MS 培養(yǎng)基中的分化情況

3 討論

激素是植物組織培養(yǎng)中器官分化的關(guān)鍵因素。 生長(zhǎng)素常用于誘導(dǎo)愈傷組織的形成和根的分化，細(xì)胞分裂素的主要生理作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)芽的形成、促進(jìn)芽的生長(zhǎng)［11］。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為10∶1 和5∶2時(shí)，出芽率均為100%。 6-BA 或KT 與NAA 濃度的比值為1∶10 時(shí)， 生根率均為100%。 低濃度的NAA 與較高濃度的6-BA 或KT 組合可促進(jìn)煙草離體葉片不定芽的分化，較高濃度的NAA 與低濃度的6-BA 或KT 組合可促進(jìn)根的形成，這與前人［10］的結(jié)果一致。 進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA 濃度一定時(shí)，培養(yǎng)基中添加6-BA 比KT 更易于誘導(dǎo)煙草葉片分化不定芽。

研究還發(fā)現(xiàn)， 雖然3 號(hào)、6 號(hào)、7 號(hào)和10 號(hào)培養(yǎng)基的NAA 與6-BA 或KT 的濃度比均為1∶1，但是它們的離體葉片出芽率和生根率卻不同。 3 號(hào)與7 號(hào)培養(yǎng)基相比，NAA 和6-BA 的濃度分別由0.1 mg／L 增加到1.0 mg／L，出芽率和生根率分別為78.34%和95%，68.34%和0。 結(jié)果顯示， 隨著NAA 和6-BA 濃度的增加， 離體葉片不定根的分化被強(qiáng)烈的抑制。 6 號(hào)和10 號(hào)中， 隨著NAA 與KT 濃度的增加，出芽率和生根率也隨之升高。 因此，NAA、6-BA 和KT 的濃度是煙草離體葉片不定器官分化的影響因素。 本實(shí)驗(yàn)與前人［9］的研究結(jié)果不盡相同，可能是由于煙草品種不同、選取的葉片外植體生理狀態(tài)不同等因素， 使得離體培養(yǎng)的葉片對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的敏感性不同， 從而影響不定器官的分化。

表2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)煙草離體葉片不定芽和不定根的影響

致謝： 本研究的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院特用作物研究中心完成，在此致謝！