晝夜節(jié)律鐘基因及TTFL 模型的發(fā)現(xiàn)歷程

任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 路彥文

（陽(yáng)泉師范高等專(zhuān)科學(xué)校 山西平定 045200）

生物鐘的研究源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。據(jù)記載，早在公元前4 世紀(jì)， 亞歷山大大帝時(shí)期就有一位船長(zhǎng)記錄羅望子樹(shù)葉晝夜開(kāi)合的現(xiàn)象。 首次提到生物節(jié)律具有內(nèi)源性（endogenous）的文獻(xiàn)是在1729 年，法國(guó)天文學(xué)家梅朗（Mairan J.O.）發(fā)現(xiàn)含羞草的羽狀復(fù)葉在完全黑暗的環(huán)境下仍然能保持24h 的開(kāi)合周期， 這表明了生物的晝夜節(jié)律鐘是并不依賴于環(huán) 境 中 的 光 照 等 外 界 環(huán) 境 條 件［1］。 1918 年，希 曼斯基（Szymansid J.S.）發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有外界光和溫度的變化，動(dòng)物仍然保持24h 的周期活動(dòng)。 20 世紀(jì)50年代前對(duì)生物鐘的研究是零星的、碎片化的，沒(méi)有進(jìn)行概念層次上的探討。 1959 年， 時(shí)間生物學(xué)（chronobiology）創(chuàng)始人哈爾伯格（Halberg F.）首先引入“晝夜節(jié)律鐘（circadian rhythm）”術(shù)語(yǔ)。 circadian 這個(gè)詞來(lái)自拉丁語(yǔ)，由circa（大約）和diem（一天）合成，即晝夜的意思［2］。晝夜節(jié)律鐘內(nèi)源性機(jī)制的揭示是從模式生物果蠅開(kāi)始的。

1 per 基因的發(fā)現(xiàn)及TTFL 模型的提出

早在1935 年，德國(guó)生物學(xué)家漢斯（Hans K.）和歐文（Erwin B.）首次各自獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)黑腹果蠅晝夜節(jié)律的存在。 1954 年，“生物鐘之父”英裔美籍科學(xué)家培騰德瑞（Pittendrigh C.）在觀察野生果蠅活動(dòng)時(shí)發(fā)現(xiàn)， 果蠅在發(fā)育期總是在一天中特定的時(shí)間羽化。他通過(guò)觀察果蠅發(fā)育的一系列行為，認(rèn)為生物鐘具有內(nèi)源性且受遺傳物質(zhì)控制， 而不是由外界環(huán)境主導(dǎo)［3］。 正是這些初始的研究啟迪后續(xù)學(xué)者在研究果蠅晝夜節(jié)律方面取得了劃時(shí)代的突破。 果蠅作為模式生物研究的優(yōu)點(diǎn)是： 個(gè)體小、繁殖快、易在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，染色體數(shù)目少，后代數(shù)量大，較容易發(fā)現(xiàn)突變類(lèi)型，這就為發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)律鐘的基因提供了有利條件。首先是美國(guó)遺傳 學(xué) 家 康 諾 普 卡（Konopka R.）和 本 澤（Benzer S，康諾普卡是本澤的首位研究生）用甲基磺酸乙酯（EMS）處理黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）誘導(dǎo)其基因組點(diǎn)突變，并在羽化期將其分離出來(lái)，然后調(diào)查2 000 只果蠅的晝夜節(jié)律鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2 000 只果蠅中，大多數(shù)是12 h 活動(dòng)，12 h 休息；但有3 種突變體具有異常節(jié)律，一種（perS）是9 h的周期，一種（perL）是8 h 的周期，還有一種（per0）似乎沒(méi)有周期， 活動(dòng)和休息的時(shí)間表現(xiàn)出隨機(jī)交替。他們用傳統(tǒng)的方法繪制出染色體圖，發(fā)現(xiàn)這些晝夜節(jié)律鐘突變型都處于X 染色體相同的位置，距白眼基因小于1 cM 的位點(diǎn)上，屬于等位基因，因與晝夜節(jié)律鐘有關(guān)，故命名為period（中文：周期；英文縮寫(xiě)per）基因。 1971 年，他們公布了研究結(jié)果，首次證實(shí)生物鐘基因的存在［4］。這一發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是步入生物鐘研究新時(shí)代的里程碑。

per 如何為生物鐘定時(shí)？1984 年，霍爾（Hall J.）和羅斯巴什（Rosbash M.）、楊（Young M.）2 個(gè)團(tuán)隊(duì)成功地分離了per 基因。 他們發(fā)現(xiàn)，perS和perL都是點(diǎn)突變，導(dǎo)致一個(gè)氨基酸發(fā)生改變（甲基磺酸乙酯的作用機(jī)制是使DNA 上的一個(gè)堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換，即A—G）；per0則引入了一個(gè)終止密碼子，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的翻譯提前終止。 1988 年，霍爾和羅斯巴什發(fā)現(xiàn)per 基因編碼的蛋白質(zhì)——PER 蛋白， 此蛋白呈現(xiàn)出夜間累積而白天降解的晝夜節(jié)律變化。1990 年， 在羅斯巴什實(shí)驗(yàn)室工作的哈?。℉ardin P.E.）等，通過(guò)檢測(cè)果蠅腦內(nèi)的mRNA 發(fā)現(xiàn)per基因轉(zhuǎn)錄的mRNA 也呈現(xiàn)晝夜變化， 而且per mRNA 峰值出現(xiàn)的時(shí)間要比PER 蛋白峰值出現(xiàn)時(shí)間早幾個(gè)小時(shí)。 他們依據(jù)per mRNA 和PER 蛋白都呈現(xiàn)的節(jié)律性變化，PER 過(guò)表達(dá)會(huì)抑制體內(nèi)per mRNA 的翻譯，并且此抑制作用表現(xiàn)出細(xì)胞負(fù)反饋調(diào)節(jié)［5］，提出了果蠅生物鐘的TTFL（Transcription-Translation Feedback Loop， 即轉(zhuǎn)錄–翻譯反饋環(huán)路）模型［1］（圖1）。

圖1 1990 年提出的果蠅晝夜節(jié)律TTFL 模型

2 per 基因的調(diào)控及TTFL 模型的深化

PER 蛋白如何進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)起作用？ 1992年， 羅斯巴什實(shí)驗(yàn)室利用免疫電鏡技術(shù)對(duì)per 基因的表達(dá)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)PER 蛋白是定位 在 細(xì) 胞 核 內(nèi) 影 響 生 物 節(jié) 律 的［6］。 1994 年，楊 實(shí)驗(yàn)室的普萊斯（Price J.L.）發(fā)現(xiàn)，位于果蠅2 號(hào)染色體上的一個(gè)基因也與晝夜節(jié)律鐘有關(guān)， 這是繼per 基因后，發(fā)現(xiàn)的第2 個(gè)生物鐘基因——timeless基因（中文：永久；英文縮寫(xiě)tim），其編碼正常晝夜節(jié)律鐘所需的TIM 蛋白。 他們發(fā)現(xiàn)，per 基因與tim 基因表達(dá)的時(shí)間基本一致， 并發(fā)現(xiàn)當(dāng)TIM 蛋白結(jié)合PER 蛋白之后，2 種蛋白質(zhì)才能進(jìn)入細(xì)胞核，在那里抑制per 基因的活性，這樣圖1 的模型更清晰（圖2）。

圖2 基于1994 年發(fā)現(xiàn)的tim 基因而深化的TTFL 示意圖

這種調(diào)控機(jī)制雖然解釋了細(xì)胞中PER 蛋白質(zhì)水平與晝夜節(jié)律鐘同步的變化， 但蛋白質(zhì)水平變化的頻率如何控制？ 1997—1998 年，楊和他在洛克菲勒大學(xué)的團(tuán)隊(duì)在果蠅3 號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)基因——doubletime 基因（中文：雙重時(shí)間或快步；英文縮寫(xiě)dbt）也參與了晝夜節(jié)律鐘的活動(dòng)，它所編碼的DBT 蛋白可延緩PER 蛋白的累積。DBT 是一種蛋白激酶，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)對(duì)PER 進(jìn)行磷酸化，使其穩(wěn)定性降低，從而易于與TIM 結(jié)合。 兩者結(jié)為異二聚體后性能穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞核［7］。 當(dāng)TIM 被降解后，PER 會(huì)從復(fù)合物中暴露出來(lái)，被DBT 磷 酸 化， 促 使PER 蛋 白 在 細(xì) 胞 核 內(nèi) 降 解［8］。這就進(jìn)一步解釋了PER 蛋白的水平變化如何與24 h 周期相匹配（圖3）。

圖3 基于1997 年發(fā)現(xiàn)的dbt 基因而深化的TTFL 示意圖

激活per 和tim 基因的起始點(diǎn)是什么？這個(gè)秘密首先是在模式生物小鼠身上揭開(kāi)的。 1994 年，日本出生的美籍神經(jīng)科學(xué)家高橋（Takahashi J.）和他的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在數(shù)周持續(xù)的光照下，一種失去晝夜節(jié)律鐘的純合突變小鼠會(huì)轉(zhuǎn)錄一種mRNA，翻譯成CLOCK（時(shí)鐘）蛋白，并與另一個(gè)基因DNA鏈結(jié)合，激活per 基因。 1998 年，霍爾和羅斯巴什等通過(guò)遺傳基因篩選， 在果蠅3 號(hào)染色體上也找到了與小鼠clock 基因同源的dClock 基因（中文：鐘，縮寫(xiě)為Clk 或jrk 基因）。 他們發(fā)現(xiàn)，dClock 基因突變會(huì)延長(zhǎng)TTFL 環(huán)路的周期， 并且這些突變導(dǎo)致果蠅PER 和TIM 蛋白含量降低，這在果蠅中不僅激活per 基因，而且激活tim 基因［9］。此外，研究人員還在3 號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)了一種被稱(chēng)作cycle（中文：循環(huán)，縮寫(xiě)為cyc）的基因（與小鼠的bmal基因同源），它翻譯成的蛋白能與CLOCK 蛋白結(jié)合形成二聚體激活per 和tim 基因。

幸運(yùn)的是另一個(gè)一直困惑科學(xué)家的問(wèn)題也幾乎同時(shí)得到解釋?zhuān)?這就是環(huán)境光強(qiáng)度對(duì)晝夜節(jié)律鐘的影響。 1996 年，塞加爾（Sehgal A.）實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)果蠅TIM 蛋白可被光降解， 在光照之后PERTIM 蛋白復(fù)合體的數(shù)量很快地下降。 1997—1998年， 霍爾實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家在對(duì)果蠅的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CRY 蛋白（Cryptochrome，亦叫隱花色素，發(fā)現(xiàn)于20 世紀(jì)50 年代，由于含量低，直到1993年科學(xué)家才用遺傳學(xué)克隆的方法在擬南芥中證實(shí)）能與PER/TIM 復(fù)合體中的TIM 作用， 促進(jìn)TIM 蛋白的降解，這樣可以防止TIM 蛋白與PER 蛋白結(jié)合抑制tim 和per 基因，從而減少抑制蛋白的數(shù)量［10］。 由此可見(jiàn)，DBT 蛋白和CRY 蛋白起到了相反的調(diào)控TIM-PER 異二聚體的作用，隱花色素被認(rèn)為具有起搏器的作用。 這樣也很好地解釋晝夜節(jié)律鐘內(nèi)因與外因的關(guān)系， 即生物鐘在外界環(huán)境影響下如何調(diào)控晝夜節(jié)律鐘的自行運(yùn)轉(zhuǎn)（圖4）。

圖4 基于1998 年發(fā)現(xiàn)的cyc 和cry 基因而深化的TTFL 示意圖

在發(fā)現(xiàn)上述果蠅生物鐘反饋調(diào)控的同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)生物鐘反饋環(huán)路， 這是基于一對(duì)等位基因vrille（中文：旋轉(zhuǎn)，縮寫(xiě)為vri）的發(fā)現(xiàn)。1997 年， 喬治 （George H） 和泰拉科爾（Terracol R.） 在用甲基磺酸乙酯誘變技術(shù)分析果蠅胚胎發(fā)育時(shí)， 發(fā)現(xiàn)有一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子涉及晝夜節(jié)律鐘的活動(dòng)。 1999 年，伯勞（Justin Blau）發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子影響CLK/CYC 復(fù)合體的功能， 這個(gè)轉(zhuǎn)錄因子就是VRI 蛋白。 這其中還涉及到另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是PDP（Pyruvate dehydrogenase phosphatase 的 縮 寫(xiě)，即丙酮酸脫氫酶磷酸酶）。 PDP 對(duì)clk 基因轉(zhuǎn)錄有正向的激活作用， 而VRI 對(duì)dClk 有負(fù)向的抑制作用，當(dāng)然也對(duì)CLK／CYC 復(fù)合體起到抑制作用。 這樣，由于CLK/CYC 的抑制，PER/TIM 降低了CLK／CYC 的抑制作用， 除per-tim 回路外， 還有一個(gè)dClk 回路（這里d 是表示英文果蠅的第1 個(gè)字母）（圖5）。

圖5 果蠅per-tim 和dCLK 回路簡(jiǎn)圖［11］

3 果蠅與其他模式生物晝夜節(jié)律鐘研究的相互促進(jìn)

需要指出的是，TTFL 模型的揭示決不是僅限于對(duì)果蠅的研究， 而是與其他模式生物的研究相互印證的。 哈丁等在1990 年提出的TTFL 模型并沒(méi)有解決是mRNA 翻譯的蛋白質(zhì)直接作用還是通過(guò)其他生化信號(hào)間接影響的問(wèn)題。 1994 年，阿倫森（Aronson B.D.）等通過(guò)對(duì)面包霉（Neurospora crassa）的研究才確定是PER 蛋白能自動(dòng)調(diào)節(jié)自己的轉(zhuǎn)錄［12］。 在晝夜節(jié)律鐘的研究中，除果蠅外，模式生物小鼠的貢獻(xiàn)同樣顯著。 1994 年，科學(xué)家用類(lèi)似研究果蠅節(jié)律基因突變的篩選方法首先描述了小鼠晝夜節(jié)律基因的突變。 1997 年，受此影響突變的基因成為第1 個(gè)被克隆的哺乳動(dòng)物生物鐘基因。隨后，小鼠晝夜節(jié)律基因的研究獲得迅速的進(jìn)展， 這些基因與晝夜節(jié)律基因果蠅基因的相似性（指核苷酸序列）也被鑒定出來(lái)。 科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，它們之間一些功能是相同的，但亦存在一些差異［13］。例如在小鼠中，CRY 蛋白是與PER 蛋白結(jié)合，形成PER/CRY 復(fù)合體，而不是像果蠅那樣，與TIM蛋白結(jié)合，形成TIM/CRY 復(fù)合體。 故果蠅是間接激活per 基因的轉(zhuǎn)錄， 但在小鼠中則是抑制該基因的表達(dá)，兩者作用相反。圖6 是從20 世紀(jì)70 年代始至20 世紀(jì)末果蠅和小鼠在晝夜節(jié)律鐘研究中的比較圖。從圖中可見(jiàn)，生物鐘的研究主要體現(xiàn)在表型和生理學(xué)、基因克隆2 個(gè)方面。 在表型、生理學(xué)方面，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了果蠅一系列的突變體、外側(cè)神經(jīng)元起搏點(diǎn)和外部振蕩器； 而在小鼠中則發(fā)現(xiàn)了視交叉上核的中心作用、 獨(dú)立的視網(wǎng)膜時(shí)鐘和外部振蕩器等； 在基因克隆方面則是克隆了一系列的突變基因， 果蠅與小鼠晝夜節(jié)律鐘的基因克隆幾乎都集中在20 世紀(jì)90 年代下半期， 基因克隆技術(shù)的應(yīng)用， 成為了揭開(kāi)生物鐘分子機(jī)制的關(guān)鍵［14］（圖6）。

圖6 1970—2000 年果蠅與哺乳動(dòng)物晝夜節(jié)律基因研究中的重要事件［14］

表1 是有關(guān)學(xué)者對(duì)小鼠與果蠅中其他涉及到晝夜節(jié)律鐘基因突變的表型作出的相互比較，這也證明了TTFL 模型具有共性。

表1 果蠅與小鼠晝夜節(jié)律鐘基因突變基因和表型的相互比較［13］

需要補(bǔ)充的是，進(jìn)入21 世紀(jì)以后，科學(xué)家的興趣逐漸從對(duì)模式生物果蠅晝夜節(jié)律鐘的研究轉(zhuǎn)移到模式生物小鼠上， 主要成果在Bmal 基因研究方面：2000 年，邦杰（Bunger M.K.）通過(guò)第1 個(gè)Bmal1基因敲除發(fā)現(xiàn)，BMAL1 蛋白對(duì)節(jié)律維持必不可少；2006 年，孔德拉托夫（Kondratov R.V.）進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Bmal1 基因敲除會(huì)使小鼠生命縮短；2015年，利普頓（Lipton J.O.）發(fā)現(xiàn)BMAL1 蛋白S42 位點(diǎn)被S6k1 周期磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)合成。 此外，2006 年，正 雄（Masao D.）和 平 山（Hirayama J.）在發(fā) 現(xiàn)CLOCK 蛋 白 是 一 種 組 蛋 白 乙 酰 酶［15］。 2008年，阿舍（Asher G.）發(fā)現(xiàn)SIRT1 通過(guò)去乙?；瘏⑴c對(duì)per2 基因的調(diào)控［16］。 可見(jiàn)，模式生物小鼠對(duì)TTFL 模型的貢獻(xiàn)并不亞于果蠅。

綜上所述， 生物鐘研究有利于準(zhǔn)確地揭示生命現(xiàn)象的規(guī)律及內(nèi)在機(jī)制，通過(guò)研究生物鐘，如今已產(chǎn)生了時(shí)辰生物學(xué)、 時(shí)辰藥理學(xué)和時(shí)辰治療學(xué)等新學(xué)科，這不僅在醫(yī)學(xué)上有著重要的意義，而且對(duì)生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究起著巨大的促進(jìn)作用。果蠅晝夜節(jié)律鐘分子機(jī)制及負(fù)反饋機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，為科學(xué)家研究其他生物和人類(lèi)生物鐘起到了先導(dǎo)作用。TTFL 模型的揭示主要是運(yùn)用了基因克隆技術(shù)和基因與蛋白質(zhì)晝夜間的振蕩表達(dá)的量化分析及各種模式生物之間的相互印證。霍爾、羅斯巴什和楊因發(fā)現(xiàn)控制晝夜節(jié)奏的分子機(jī)制分享了2017 年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 當(dāng)然，生物鐘中還有許多秘密有待進(jìn)一步揭開(kāi)， 期待科學(xué)家的下一個(gè)研究成果。