梅光明，常家琪，朱羽莊，嚴(yán) 國，孟春英

(浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

海產(chǎn)品是人體攝入砷的主要貢獻者[1-3]，特別是貝類、蟹類為砷元素的高富集品種。為了提高海產(chǎn)品的可口性，通常會對其進行烹飪加工，不同的加工方式有可能會使產(chǎn)品中的砷含量及形態(tài)發(fā)生變化，造成毒性降低或產(chǎn)生毒性更大的化合物[4]。有研究報道無毒的砷糖在一些人為條件下可轉(zhuǎn)化為二甲基砷酸、二乙基砷酰乙醇等毒性較強的砷化合物[5]。ICHIKAWA,et al 等[6]研究發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)過浸泡、蒸煮等步驟就能去除約90%的砷；SARTAL,et al[1]對煮熟海藻樣品、烹飪水以及模擬體外消化獲得的熟海藻透析液定量定性研究發(fā)現(xiàn)，海藻樣品中的部分砷會在烹飪過程中從海藻基質(zhì)移出并釋放到水中，不同砷化合物在不同品種海藻中的透析性或溶解性有所差異。因此科學(xué)評價海產(chǎn)品中砷污染帶來的健康影響程度，一方面需要對其進行砷污染狀況測定，另一方面還要關(guān)注樣品中砷化合物的生物可給性和生物利用度研究。生物可給性指從胃腸道中的基質(zhì)中釋放出類可用于腸吸收的部分，生物利用度指的是能夠到達(dá)全身循環(huán)代謝的外部劑量。生物可給性可以通過體外或者體內(nèi)模擬實驗進行評估，體內(nèi)實驗和體外實驗是研究污染物生物可給性的主要評價方法[7-8]。采用與人體結(jié)構(gòu)相似的動物模型進行體內(nèi)實驗的結(jié)果一般被認(rèn)為是準(zhǔn)確可靠的，但動物實驗因其所需周期長、實驗成本高、不可控因子多等因素導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制[9-10]。體外環(huán)境模擬實驗成為研究污染物在人體生物有效性的又一有效方法，該方法因具有簡單易操作、可重現(xiàn)性良好、精確度高且實驗成本低等優(yōu)點而獲得廣泛應(yīng)用[11-14]。本實驗以砷元素富集能力較強的厚殼貽貝Mytilus coruscus 和三疣梭子蟹Portunus trituberculatus 為研究對象，采用體外仿生消化模擬實驗，分別對原料樣品、蒸煮樣品、蒸煮水和胃腸仿生消化處理樣品中的總砷及砷形態(tài)進行定量與定性測定，初步探討食品加工處理和胃腸消化下砷元素化合物轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梭子蟹和貽貝均購于浙江舟山豐茂菜場，正值上市銷售的健康鮮活品。三疣梭子蟹規(guī)格為300～400 g/只，厚殼貽貝殼長8～9 cm/粒。

砷甜菜堿AsB 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08670)、一甲基砷MMA 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08668)、二甲基砷DMA 溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08669)、砷酸根As(Ⅴ)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 08667)、亞砷酸根As(Ⅲ)溶液(GBW 08666)，中國計量科學(xué)研究院；砷單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg·mL-1，GSB04-1714-2004)，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；大蝦粉(GBW10050)生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、紫菜粉(GBW10023)生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，地球物理地球化學(xué)勘查研究所；BCR-627 金槍魚組織中砷不同形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，歐洲標(biāo)準(zhǔn)局；碳酸銨，德國Sigma 公司；正己烷(色譜純)，德國Merck 公司；濃硝酸(農(nóng)殘級)，美國J.T.Baker 公司；濃鹽酸、氨水，均為優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)譜調(diào)諧液(10 μg·L-1Ce、Co、Li、Tl、Y)和內(nèi)標(biāo)溶液(100 μg·mL-1Rh)，美國Agilent 公司；PIPES(哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)二鈉鹽)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；膽酸鈉和脫氧膽酸鈉，東京化成工業(yè)株式會社；胰液素(CFAD-P1750，來源于豬胰腺) 和胃蛋白酶(CFADP7012)，上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水為Milli-Q 制備超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTM H-class 液相色譜儀，美國Waters 公司；7900 型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國Agilent 公司；Centrifuge 5810 高速離心機，德國Eppendorf 公司；MS2 漩渦混合器，德國IK 公司；AL204 型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；pH 計，德國Sartorius 公司；ETHOS 1 型微波消解儀，附有聚四氟乙烯消解罐，意大利Milestone 公司；EH20A plus 型微控數(shù)顯電熱板，北京菜伯泰科儀器股份有限公司；氣浴恒溫振蕩器，江蘇常州國華電器公司；FreeZone 型冷凍干燥機，美國Labconco 公司；Spectra/pro 6 Dialysis Menbrane(10 KD)，美國Spectrum Laboratories 公司；Dionex IonPac As19 陰離子交換柱(250 mm×4 mm×10 μm)及保護住(50 mm×4 mm)，美國Thermo 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液配制

透析溶液：稱量PIPES(哌嗪-1,4-雙(2-乙磺酸)二鈉鹽)5.194 8 g，超純水定容至100 mL。

模擬新鮮胃液：準(zhǔn)確稱量0.3 g(精確至0.01 g)胃蛋白酶，用0.1 M 硝酸定容至5 mL。

模擬新鮮腸液：準(zhǔn)確稱取胰液素0.4 g，膽酸鈉和脫氧膽酸鈉各1.25 g，均溶于0.1 M 碳酸氫鈉溶液中，超聲均勻后用0.1 M 碳酸氫鈉溶液定容至100 mL。

1.3.2 樣品制備

1.3.2.1 原料樣品制備

按照《GB/T 30891-2014 水產(chǎn)品抽樣規(guī)范》[15]采集樣品并處理后作為原料樣品。

1.3.2.2 樣品的蒸煮過程

將約1 kg 的梭子蟹(整蟹)置于煮鍋內(nèi)，鍋內(nèi)添加2 000 mL 超純水，電磁爐功率設(shè)置2 000 W，進行梭子蟹蒸煮(3～5 min)。1 kg 貽貝蒸煮過程同上，時間控制5～8 min。兩種樣品的蒸煮水經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后儲存聚乙烯瓶中保存。

1.3.2.3 樣品的干燥

取上述煮熟后的梭子蟹和貽貝取可食組織后用研缽充分研細(xì)得到均勻樣品(稱煮熟樣品)，和原料樣品一起經(jīng)冷凍干燥36 h 后取出，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.4 胃腸仿生消化處理

準(zhǔn)確稱量0.5 g（精確至0.000 1 g）置于100 mL 錐形瓶中，加入20 mL 超純水充分振搖15 min 后用6 mol·L-1的HCl 調(diào)節(jié)溶液pH 至2.0。加入模擬新鮮胃液0.15 g，振搖均勻后用保鮮膜將錐形瓶封口，置于150 r·min-1、37 ℃恒溫條件的氣浴搖床孵育2 h。取出后于冰水浴中放置10～15 min 進行停止酶反應(yīng)。溶液恢復(fù)至室溫后，準(zhǔn)確移取5 mL 模擬新鮮腸液加入上述錐形瓶內(nèi)，同時在10 KD 透析袋內(nèi)加入20 mL 透析溶液后用專用封口夾將其兩端緊封后置于錐形瓶內(nèi)，然后再次將錐形瓶置于150 r·min-1、37 ℃恒溫條件的氣浴搖床孵育2 h，取出后冰水浴10～15 min 停止酶反應(yīng)。用超純水沖洗透析袋表面后，將里面透析液轉(zhuǎn)移至聚乙烯瓶中并稱重，得到透析樣品，置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總砷測定前處理

準(zhǔn)確稱量0.2 g（精確至0.000 1 g）冷凍干燥過的樣品于聚四氟乙烯消解罐中，依次加入6.0 mL 硝酸、2.0 mL 過氧化氫溶液，搖勻后加蓋放置過夜，使樣品進行預(yù)消解。次日將消解罐放入微波消解系統(tǒng)中，設(shè)置適宜的微波消解程序（表1），按照相關(guān)消解步驟進行消解。消解完畢后，170～180 ℃下于趕酸架上加熱趕酸至1～2 mL，冷卻至室溫后用超純水定容至50 mL，采用ICP-MS 上機測定。同時做試劑空白實驗，采用大蝦粉和紫菜粉作為質(zhì)控樣進行結(jié)果質(zhì)量控制。

蒸煮水樣品的總砷含量測定參照《HJ 700-2014 水質(zhì)65 種元素的測定 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》[16]中的前處理進行。

表1 微波消解程序Tab.1 Microwave digestion procedure

1.3.4 砷形態(tài)前處理

準(zhǔn)確稱量0.25 g（精確至0.000 1 g）冷凍干燥后的待測樣品于50 mL 離心管中，加入20 mL 0.15 mol·L-1硝酸溶液，3 000 r·min-1渦旋1 min，置于氣浴恒溫振蕩器中(50 ℃、150 r·min-1)，過夜振蕩提取，提取完畢后次日取出，冷卻至室溫，3 000 r·min-1渦旋30 s，6 000 r·min-1離心8 min。移取5 mL 上清液于15 mL 離心管中，加入正己烷3 mL，3 000 r·min-1渦旋1 min 后再6 000 r·min-1離心8 min，棄去上方正己烷層。吸取下層清液，經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后進行HPLC-ICP-MS 分析。按相同操作方法做試劑空白實驗，同時采用樣品加標(biāo)計算回收率。

蒸煮水樣品直接經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后進行HPLC-ICP-MS 分析。

1.3.5 測定方法

1.3.5.1 總砷含量測定

使用1.0 μg·L-1Ce、Co、Li、Tl、Y 的調(diào)諧液在線優(yōu)化ICP-MS 各項參數(shù)，使分辨率和靈敏度等各項儀器性能達(dá)到最佳?？偵楹繙y定時采用1.0 μg·mL-1103Rh 溶液在線加入內(nèi)標(biāo)，用于校正儀器響應(yīng)信號的變化。優(yōu)化后ICP-MS 的主要參數(shù)見表2。將砷元素標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液從低濃度到高濃度依次于ICP-MS 中進樣，測定相應(yīng)的信號值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的信號值(CPS 計數(shù))為縱坐標(biāo)，儀器自動繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度與相應(yīng)信號強度成正比。采用外標(biāo)法定量分別測定總砷含量。

表2 ICP-MS 主要參數(shù)Tab.2 The major parameters of ICP-MS

同時用大蝦粉（GBW10023）和紫菜粉（GBW10050）生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)驗證樣品總砷含量測定方法的準(zhǔn)確性。兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值、測定值和RSD 值見表3。由表3 可知，2 種質(zhì)控樣品總砷含量測定值都在標(biāo)準(zhǔn)值范圍內(nèi)說明該方法準(zhǔn)確度高、精密度好。

表3 質(zhì)控樣品總砷含量水平的測定(n=8)Tab.3 Determination of total arsenic levels in quality control samples(n=8)

1.3.5.2 砷形態(tài)的測定

色譜條件：Dionex IonPac As19 陰離子交換柱(250 mm×4 mm×10 μm)及保護柱(50 mm×4 mm)；進樣量50 μL；樣品室溫度10 ℃，柱溫40 ℃；流動相為50 mmol·L-1、pH=9.5 的碳酸銨溶液；等度洗脫；流速1.0 ml·min-1。

質(zhì)譜條件：采用具有同心霧化器的電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；選擇元素75As；m/z 75；采集模式：TRA模式；As 積分時間：0.3 s；蠕動泵轉(zhuǎn)速：0.5 r·s-1

砷形態(tài)測定方法的準(zhǔn)確度用BCR-627 金槍魚組織中砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來驗證。準(zhǔn)確稱量BCR-627 金槍魚組織中砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.5 g，其中含砷甜菜堿參考值為3.9±0.225 mg·kg-1，二甲基砷含量參考值0.15±0.022 5 mg·kg-1。按照本實驗方法進行的6 次平行測定結(jié)果為：砷甜菜堿含量范圍為3.794～4.056 mg·kg-1，二甲基砷測定值范圍0.132 8～0.167 4 mg·kg-1，相對偏差分別為4.2%和4.6%，均在參考值范圍內(nèi)，說明本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確度高。

2 結(jié)果與討論

2.1 用ICP-MS 測定樣品中的總砷

通過ICP-MS 分別測定未經(jīng)加工的貽貝和梭子蟹樣品原料樣品、二者煮熟樣品、蒸煮水和胃腸模擬消化液處理樣品的總砷含量。未經(jīng)加工的原始樣品中貽貝含砷量為11.36±1.8 mg·kg-1，梭子蟹總砷含量為78.97±3.7 mg·kg-1；煮熟樣品中貽貝的砷含量為10.47±0.3 mg·kg-1，梭子蟹的砷含量為73.37±1.4 mg·kg-1（考慮到烹飪過程中的質(zhì)量損失，結(jié)果表示均以干重計）。對貽貝和梭子蟹的蒸煮水中總砷含量測定值分別為1.56±0.11 mg·kg-1和4.81±0.6 mg·kg-1。結(jié)果表明在蒸煮加熱過程中，貽貝樣品中13.7%±1.62%的總砷量和梭子蟹樣品中6.1%±0.92%的總砷量從樣品中轉(zhuǎn)移至蒸煮水中。在靜態(tài)體外胃腸模擬消化實驗中，獲得的貽貝透析樣品總砷含量為0.24±0.06 mg·kg-1，梭子蟹透析樣品總砷含量為2.59±0.13 mg·kg-1。該結(jié)果表明煮熟的貽貝樣品中大約2.3%±0.47%的總砷量是可以經(jīng)過透析袋，煮熟的梭子蟹樣品中大約3.5%±0.75%的總砷量可透析。

圖1 貽貝和梭子蟹原樣、煮熟樣品、蒸煮液和模擬體外胃腸消化后獲得的透析樣品中總砷測定Fig.1 Total arsenic contents of mussels and crab in raw materials,cooked samples,cooking fluids and dialysis after vitro gastrointestinal digestion

2.2 通過陰離子交換HPLC-ICP-MS 分析砷形態(tài)

圖3 為梭子蟹和貽貝未經(jīng)加工時的原料樣品中的砷形態(tài)HPLC-ICP-MS 測定圖譜。與5 種砷化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖2)進行對比后，發(fā)現(xiàn)梭子蟹原始樣品中砷元素存在形態(tài)以AsB 為主，含少量DMA；貽貝樣品中含有4 種砷化合物，含量大小為AsB>MMA>As(Ⅴ)>DMA。

圖2 5 種砷形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of five arsenic speciation standard solution

圖3 HPLC-ICP-MS 測定梭子蟹原始樣品(左)和貽貝原始樣品(右)中的砷形態(tài)洗脫曲線Fig.3 Elution profiles of As species of mussels and crabs in raw by anion-exchange HPLC-ICP-MS

圖4 為梭子蟹和貽貝煮熟樣品中砷化合物的HPLC-ICP-MS 測定圖譜。從圖中發(fā)現(xiàn)，貽貝經(jīng)過蒸煮過程后并未引起砷形態(tài)的改變，其砷形態(tài)種類與未蒸煮前相同；但梭子蟹蒸煮后，除AsB 外，有微量As(Ⅴ)檢出。圖3 和圖4 比較可以看出，熱處理過程幾乎不會引起貽貝樣品中砷形態(tài)的變化，但對梭子蟹產(chǎn)生了較小影響。

圖5 顯示了兩種不同樣品進行蒸煮后得到的蒸煮水中砷形態(tài)的HPLC-ICP-MS 測定圖譜。在蒸煮過程中，砷化合物被釋放到蒸煮水中，圖4 和圖5 比較發(fā)現(xiàn)，二者蒸煮水中的砷化合物種類與煮熟樣品中發(fā)現(xiàn)的相同，以AsB 含量為主。

接著對梭子蟹和貽貝煮熟樣品進行體外胃腸模擬消化后獲得的透析樣品進行砷形態(tài)定性研究。圖6是透析樣品的砷元素HPLC-ICP-MS 測定圖譜，結(jié)果表明體外胃腸模擬消化過程中沒有引起梭子蟹砷形態(tài)變化。而在貽貝透析樣品中，新出現(xiàn)一未知形態(tài)的砷峰。

圖4 HPLC-ICP-MS 測定梭子蟹(左)和貽貝(右)煮熟樣品中的砷形態(tài)分布曲線Fig.4 Elution profiles of As species of cooked mussels and crabs by anion-exchange HPLC-ICP-MS

圖5 HPLC-ICP-MS 測定梭子蟹(左)和貽貝(右)蒸煮水中的砷形態(tài)洗脫曲線Fig.5 Elution profiles of As species in the cooking water of mussels and crabs by anion-exchange HPLC-ICP-MS

圖6 HPLC-ICP-MS 測定梭子蟹(左)和貽貝(右)煮熟樣品透析液中砷形態(tài)分布曲線Fig.6 Elution profiles of As species in the in-vitro obtained dialysates of cooked mussels and crabs by anion-exchange HPLC-ICP-MS

表4 為梭子蟹和貽貝原始樣品、蒸煮樣品、蒸煮水以及透析樣品中5 種砷化合物的測定色譜峰面積相對百分比情況。結(jié)果表明AsB 作為梭子蟹和貽貝中含量最高的砷化合物，經(jīng)過蒸煮、胃腸模擬消化和透析后，AsB 仍是所有樣品中含量最高的砷形態(tài)物，其它砷形態(tài)物分布占比情況有所差別。AsB 是煮熟貽貝透析液中含量最高的砷形態(tài)，但透析液中As(Ⅴ)和MMA 增加了其相對面積百分比，AsB 和DMA 相對百分比減少，這表明在貽貝樣品中，DMA 相對As(Ⅴ)和MMA 的溶解性差或者透析性低。梭子蟹中砷化合物也始終以AsB 為主，其面積相對百分比均大于99%。梭子蟹原始樣品中有少量的DMA 檢出，而在煮熟樣品和透析樣品中均沒有檢出DMA，而產(chǎn)生了微量的As(Ⅴ)，在梭子蟹蒸煮水中僅檢測出AsB。研究結(jié)果表明，加熱蒸煮、胃腸模擬消化和透析等過程對樣品中的砷形態(tài)物改變影響不顯著。

表4 原始樣品、煮熟樣品、蒸煮水和煮熟樣品透析液中砷形態(tài)的相對面積百分比(n=8)Tab.4 Relative area percentages of arsenic species in raw samples,cooked samples,cooking water and dialysates of cooking samples(n=8)

3 結(jié)論

通過建立靜態(tài)體外胃腸模擬實驗，分別對梭子蟹和貽貝原料樣品、蒸煮樣品、蒸煮水和蒸煮樣品經(jīng)胃腸模擬消化及透析后的樣品中砷形態(tài)分布特征進行定量與定性研究。結(jié)果顯示貽貝樣品中13.7%±1.62%的總砷和梭子蟹樣品中6.1%±0.92%的總砷量在蒸煮過程中可以從樣品基質(zhì)轉(zhuǎn)移并釋放到蒸煮水中；煮熟的貽貝樣品經(jīng)模擬胃腸消化液處理后有2.3%±0.47%的總砷量和煮熟的梭子蟹樣品經(jīng)模擬胃腸消化液處理后有3.5%±0.75%的總砷量可透析并最終可能參與人體循環(huán)代謝；定性研究發(fā)現(xiàn)，加熱蒸煮和胃腸模擬消化等過程對樣品中的砷形態(tài)物種類及含量影響改變不顯著。