不同保護(hù)劑影響植物乳桿菌凍干菌粉發(fā)酵活力的研究

趙延勝，吳超，王慧，周洪斌，董英，*

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000）

采用真空冷凍干燥技術(shù)可以提高乳酸菌的保藏期，是制備高效直投式乳酸菌發(fā)酵劑最常用的技術(shù)手段[1]。但經(jīng)過凍干處理后，菌體在貯藏期間其極易遭受冷凍、氧化、融化等過程的損傷，從而影響其貯藏特性[2]。凍干保護(hù)劑的添加可以一定程度上降低菌體在凍干過程中的損傷，提高凍干菌粉的貯藏和發(fā)酵性能[3]。目前，活菌數(shù)和細(xì)胞活力是評(píng)價(jià)菌體貯藏穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，而凍干保護(hù)劑的研究和開發(fā)一般多關(guān)注于凍干和貯藏過程中菌體細(xì)胞的存活率，對(duì)于保護(hù)劑影響貯藏期間乳酸菌細(xì)胞發(fā)酵活力的作用研究相對(duì)較少。

本文在前期研究工作基礎(chǔ)上[4]，以植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum CGMCC 6016 ，L.P.dy-1） 為研對(duì)象，分析不同凍干保護(hù)劑對(duì)凍干菌體貯藏期間活菌數(shù)的影響，并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）分析保護(hù)劑對(duì)菌體凍干后發(fā)酵活力的影響；在此基礎(chǔ)上，研究貯藏過程中凍干菌粉發(fā)酵活力的變化，比較不同保護(hù)劑對(duì)凍干菌粉的保護(hù)效果，為進(jìn)一步開發(fā)乳酸菌功能性保護(hù)劑，以及提高直投式乳酸菌發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性，提供理論與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L.P.dy-1：由江蘇大學(xué)食品生物制造實(shí)驗(yàn)室自行分離；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、甘油、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、鹽酸、乙醇、氫氧化鈉、甲醇、百里酚酞、果糖等均為二級(jí)試劑：醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑有限公司；二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：上海生工生物工程公司；羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂 [5-（and 6）-car boxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE]：e-Bioscience 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A 型鼓風(fēng)干燥機(jī)：上海一恒科技有限公司；HJ-3 控溫磁力攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠；YX400Z 高壓滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID 型超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；JLQ-S1 型菌落計(jì)數(shù)器：江蘇錫山市金誠儀器廠；7200型分光光度計(jì)：上海天達(dá)儀器有限公司；FD-8 真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；5430R 高速冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf 公司；FACSCalibur 型流式細(xì)胞儀：美國Becton Dickinson 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 凍干菌粉的制備

直投式發(fā)酵劑的制備流程如下：

菌種活化→擴(kuò)培→菌體濃縮分離→與保護(hù)劑混合→分裝、預(yù)凍→凍干

選用質(zhì)量濃度分別為10 %的菊粉、22.4 %的菊粉、菊粉復(fù)合保護(hù)劑和脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑制備凍干菌粉[4]，將制備好的凍干菌粉經(jīng)真空包裝后，分別于-20 ℃和4 ℃條件下貯藏。

1.3.2 凍干菌粉發(fā)酵樣品的制備

前期試驗(yàn)研究表明，添加不同保護(hù)劑制備的凍干菌粉發(fā)酵MRS 培養(yǎng)基（營養(yǎng)富集培養(yǎng)基）時(shí)，細(xì)胞活力無顯著性差異，而發(fā)酵營養(yǎng)匱乏培養(yǎng)基時(shí)菌體產(chǎn)酸能力不同[4]。因此本試驗(yàn)選用10%質(zhì)量濃度的菊芋浸汁用于測(cè)定凍干菌體的細(xì)胞活力，其制備過程參考程新等方法[5]，但不添加任何碳氮源及礦物元素。在34 ℃條件下，按以下方式發(fā)酵10%菊芋浸汁[6]：

1）直接活化發(fā)酵：取-20 ℃保存菌種，按5%接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基中，34 ℃、12 h 活化培養(yǎng)兩次后（活菌數(shù)為 2×109CFU/mL～3×109CFU/mL），以 5%接種量加入10%菊芋浸汁。

2）直投式發(fā)酵：采用1.3.1 中添加不同保護(hù)劑制備的乳酸菌凍干菌粉（活菌數(shù)為2×1010CFU/g～6×1010CFU/g）以0.5 g/L 的接種量加入10%菊芋浸汁。

1.3.3 無細(xì)胞發(fā)酵液的制備

每隔3 h 取1.3.2 中的發(fā)酵液于無菌離心管中，在4 ℃，3 996×g 離心 10 min 后，取上清液保存于 4 ℃，用于還原糖、總糖的測(cè)定。

1.3.4 發(fā)酵液分析方法

發(fā)酵液還原糖和總糖的測(cè)定采用DNS 比色法。還原糖測(cè)定：吸取無細(xì)胞發(fā)酵液2 mL，準(zhǔn)確加入2 mL DNS，沸水浴3 min 后立即冷卻，加入6 mL 蒸餾水，混合均勻后于540 nm 波長處測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中還原糖含量?？偺菧y(cè)定：吸取無細(xì)胞發(fā)酵液5 mL，用6 mol/L 的鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2.0，沸水浴中水解1 h，然后用6 mol/L NaOH 調(diào)至pH 值為8 左右，定容至10 mL。準(zhǔn)確吸取樣品2 mL，之后操作與還原糖測(cè)定法相同。

pH 值和活菌數(shù)的測(cè)定分別采用pH 計(jì)和梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法。

1.3.5 乳酸菌增殖的測(cè)定方法

將制備的凍干菌粉直投發(fā)酵10%菊芋浸汁，初始接菌量控制在 1×107CFU/mL～3×107CFU/mL，立即取1 mL 菌液，4 ℃、3 996×g 離心 5 min，再用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌 2 次后，重懸至 1 mL，加入 100 μL 濃度為 50 μmol/L 的CFSE，37 ℃避光孵育10 min 后，離心、洗滌2 次。最終懸浮于1 mL 滅菌的10%菊芋浸汁中，34 ℃培養(yǎng)，并分別在6、12 h 取樣，離心、洗滌，重懸于等體積的 PBS 中，過200 目濾網(wǎng)，采用流式細(xì)胞儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)光源為氬離子激光，激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為488 nm和630 nm，檢測(cè)器波長為530 nm，不設(shè)門，圈定待檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞，并通過CellQuest 軟件分析細(xì)胞數(shù)據(jù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 17.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 保護(hù)劑對(duì)凍干菌粉貯藏期活菌數(shù)的影響

在凍干菌粉貯藏過程中，溫度是影響菌體存活率的關(guān)鍵因素之一[7]。高溫及干燥條件會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)發(fā)生非酶褐變,引起菌體失活。研究報(bào)道表明，高溫會(huì)加速凍干制品的融化、含水量變化和相變的發(fā)生等問題，因此溫度升高，凍干樣品的貯藏穩(wěn)定性變差。保護(hù)劑對(duì)L.P.dy-1 凍干菌粉貯藏期間活菌數(shù)的影響見圖1。

從圖1 可以看出，采用不同保護(hù)劑制備的凍干菌粉在-20 ℃貯藏8 個(gè)月，活菌數(shù)均保持在1010CFU/g 以上，且不同處理組無顯著差異；而在4 ℃下貯藏1 個(gè)月后，不同保護(hù)劑組的活菌數(shù)則發(fā)生變化，尤其4 ℃下貯藏6 個(gè)月時(shí)的活菌數(shù)下降最為顯著。表明低溫更有利于菌體活菌數(shù)的保持，該結(jié)果與已有研究報(bào)道一致[8]。

圖1 保護(hù)劑對(duì)L.P.dy-1 凍干菌粉貯藏期間活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect on the viable count of freeze-dried L.P.dy-1 during storage by cryoprotectant

此外，保護(hù)劑的種類也會(huì)影響凍干菌粉貯藏期間活菌數(shù)的變化。如圖1所示，4 ℃貯藏1 個(gè)月，活菌數(shù)均保持在1.7×1010CFU/g 以上；菊粉復(fù)合保護(hù)劑組、22.4%菊粉組和脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組分別在4 ℃貯藏6 個(gè)月、4 個(gè)月和4 個(gè)月，活菌數(shù)仍能夠維持在1010CFU/g 以上，但8 個(gè)月后菌粉活菌數(shù)降低約1 個(gè)數(shù)量級(jí)。菌粉的貯藏穩(wěn)定性強(qiáng)弱順序?yàn)椋壕辗蹚?fù)合保護(hù)劑組＞22.4%菊粉組＞脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組＞10 %菊粉組。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用菊粉復(fù)合保護(hù)劑制備的凍干菌粉貯藏穩(wěn)定性最佳，且分別在-20 ℃和4 ℃保藏8 個(gè)月后，活菌數(shù)可分別達(dá)到（2.07±0.05）×1010CFU/g 和（0.94±0.17）×1010CFU/g，較其他保護(hù)劑組高。

2.2 保護(hù)劑對(duì)凍干菌粉發(fā)酵活力的影響

以直接活化發(fā)酵組作為對(duì)照，采用不同保護(hù)劑制備凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中L.P.dy-1 活菌數(shù)、pH 值、還原糖及總糖的動(dòng)態(tài)變化如圖2所示。

圖2 保護(hù)劑對(duì)L.P.dy-1 凍干菌粉發(fā)酵活力的影響Fig.2 Effect on the fermentation activity of freeze-dried L.P.dy-1 by cryoprotectant

保護(hù)劑是影響凍干后植物乳桿菌產(chǎn)酸能力的重要因素。由圖2 可知，相比直接活化組，添加保護(hù)劑的乳酸菌凍干后發(fā)酵10%菊芋浸汁的活力均有所下降，表現(xiàn)在發(fā)酵過程中活菌數(shù)的增長和產(chǎn)酸（pH 值）速度有所降低，其中脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組中的活菌數(shù)一直處于最低水平，且pH 值相對(duì)較高；菊粉保護(hù)劑組相互之間無顯著性差異，且在活菌數(shù)和產(chǎn)酸變化上較接近于活化組。

在整個(gè)發(fā)酵過程中，還原糖和總糖的含量越來越少，這與L.P.dy-1 的迅速生長和產(chǎn)酸相符合；發(fā)酵12 h 后，還原糖含量變化緩慢，可能是由于總糖的分解，L.P.dy-1 消耗的速度和分解產(chǎn)生的速度相均衡。在發(fā)酵后期，發(fā)酵液中還原糖和總糖含量幾乎不變，這可能由于酸的積累造成L.P.dy-1 代謝速度降低。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，直接活化組的還原糖和總糖降低速度稍高于凍干組，菊粉復(fù)合保護(hù)劑組的糖代謝速率高于脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組，這與圖2A、圖2B 的結(jié)果相一致。

2.3 貯藏時(shí)間及溫度對(duì)凍干菌粉發(fā)酵活力的影響

在貯藏期間，L.P.dy-1 凍干菌粉的發(fā)酵活力變化如圖3所示。

圖3 L.P.dy-1 凍干菌粉貯藏期間pH 值的變化Fig.3 Variation in the pH value of fermentation freeze-dried L.P.dy-1 with different storage time

凍干菌粉在-20 ℃保藏6 個(gè)月和4 ℃保藏4 個(gè)月后，均能夠維持較高的產(chǎn)酸活力；隨著貯藏時(shí)間的延長，菌粉的產(chǎn)酸能力明顯下降，這可能與貯藏過程中活菌數(shù)的變化有關(guān)[9]；本試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)表明，低溫貯藏更有利于菌體活力的維持，該結(jié)果與已有研究報(bào)道相一致[10]。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)凍干菌粉發(fā)酵活力的評(píng)價(jià)

CFSE 是一種能透過細(xì)胞膜且在胞內(nèi)被酯酶轉(zhuǎn)化的非極性分子，當(dāng)細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE 標(biāo)記物能夠平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞中，使細(xì)胞的CFSE 熒光強(qiáng)度減半。FCM 已被作為一種技術(shù)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞領(lǐng)域[11]，而且可以快速的測(cè)定凍干后菌體的存活率[12]，并描述凍干菌體的生理狀態(tài)[13]。因此，可利用CFSE 熒光強(qiáng)度的2 倍遞減特性，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)（CFSE-FCM）檢測(cè)L.P.dy-1 的增殖。試驗(yàn)分別采用直接活化L.P.dy-1、菊粉保護(hù)劑凍干菌粉、脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁，分析測(cè)定發(fā)酵液中pH 值和菌體熒光強(qiáng)度如圖4。

圖4 pH 值與CFSE-FCM 測(cè)定菌體熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系Fig.4 Linear relationship between pH value and the fluorescence intensity of cells CFSE-FCM measured

如圖4所示，3 組L.P.dy-1 被顯著區(qū)分，左邊pH值最低的為直接活化組，中間3 組稍高pH 值的為菊粉保護(hù)劑組，右邊pH 值最高的為脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組。pH 值與CFSE-FCM 的熒光強(qiáng)度之間表現(xiàn)出良好的相關(guān)性，R2值達(dá)到0.77，說明這兩種測(cè)定指標(biāo)均可用于植物乳桿菌細(xì)胞活力的分析。

將不同處理組的L.P.dy-1 凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁，采用CFSE-FCM 分析其細(xì)胞增殖情況，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 CFSE 標(biāo)記 L.P.dy-1 培養(yǎng) 0、6、12 h 后熒光強(qiáng)度的變化Fig.5 The fluorescence intensity of CFSE-labeled cells in cultured 0，6，12 h

由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同發(fā)酵時(shí)間的菌體細(xì)胞熒光強(qiáng)度有明顯的差異，圖A1～C1和圖A2～C2表示隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，CFSE 標(biāo)記L.P.dy-1 細(xì)胞的直方圖和散點(diǎn)圖明顯向左遷移，說明熒光強(qiáng)度明顯減弱。圖5 中E 和F 代表不同保護(hù)劑制備的凍干菌粉發(fā)酵10%菊芋浸汁6 h 和12 h 時(shí)的直方圖，各組之間的差異如表1所示。

表1 L.P.dy-1 隨發(fā)酵時(shí)間熒光強(qiáng)度的變化情況Table 1 The fluorescence intensity of cells CFSE-FCM measured in different periods

凍干處理后菌體較凍干前（直接活化組）在6、12 h的熒光強(qiáng)度總體偏大。當(dāng)以菊粉作為保護(hù)劑時(shí)，隨著菊粉濃度的增加，制備的凍干菌體的熒光強(qiáng)度減弱，說明高濃度的菊粉有利于菌體的增殖。其中，與脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組相比，菊粉保護(hù)劑組和直接活化組之間熒光強(qiáng)度的差異較小。

3 結(jié)論

低溫貯藏有利于維持植物乳桿菌凍干菌粉更高的發(fā)酵活力：與4 ℃貯藏條件相比，-20 ℃貯藏能夠使植物乳桿菌的活菌數(shù)和產(chǎn)酸能力維持在較高水平；在以10%菊芋浸汁為發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，以菊粉作為保護(hù)劑制備的植物乳桿菌凍干菌粉能夠維持較高的發(fā)酵活力，表現(xiàn)在植物乳桿菌生長迅速、產(chǎn)酸能力強(qiáng)、還原糖和總糖的消耗速度快，且總體效果優(yōu)于脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑制備的植物乳桿菌凍干菌粉。

流式細(xì)胞儀能夠快速評(píng)價(jià)不同保護(hù)劑處理凍干植物乳桿菌后細(xì)胞的增殖，其中菊粉保護(hù)劑組和直接活化組的細(xì)胞增殖更為接近，優(yōu)于脫脂乳復(fù)合保護(hù)劑組。pH 值及CFSE-FCM 測(cè)定法的關(guān)聯(lián)度良好，表明CFSE-FCM 適合凍干植物乳桿菌細(xì)胞活力的研究。