解修超，劉軍生，羅陽蘭，鄧百萬，柏秋月，張毓文

（陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001）

姬松茸（Agaricus blazei）又名巴西蘑菇，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、蘑菇科（Agaricaceae）、蘑菇屬（Agaricus），原產(chǎn)于巴西、秘魯和美國等地，后被引進(jìn)日本和中國等國家，并對(duì)其進(jìn)行了深入研究。研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸具有較高的食藥用價(jià)值，富含多種活性成分，與白蘑菇的親緣關(guān)系較近，其多糖含量更是食用蕈菌之首[1]。近年來相關(guān)學(xué)者對(duì)姬松茸多糖在抗氧化[2]，抗疲勞[3]，抗炎[4]，抗腫瘤[5-6]，抗衰老[7]，降血糖[8]等方面的作用進(jìn)行了深入研究，表明姬松茸多糖在糖尿病[9]、肥胖癥等疾病的治療方面具有一定的潛在價(jià)值。

然而目前，一方面對(duì)姬松茸多糖的研究主要集中在胞內(nèi)多糖，對(duì)胞外多糖研究較少，僅有關(guān)于姬松茸胞外多糖抗氧化活性的初步報(bào)道[10]，尚無系統(tǒng)性的研究，相對(duì)于胞內(nèi)多糖而言，胞外多糖提取加工方便，成本較低[11]；另一方面，國內(nèi)目前用于生產(chǎn)或研究的姬松茸種大部分來源于巴西和日本等地，我國品質(zhì)優(yōu)良的姬松茸菌株稀缺，種質(zhì)資源嚴(yán)重不足[12-13]，優(yōu)良菌株亟待篩選補(bǔ)充。本研究利用4 株姬松茸菌株采用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)胞外多糖，測定其胞外多糖產(chǎn)量并考察其抑菌、抗氧化、抑制α-淀粉酶活性，篩選產(chǎn)胞外多糖的優(yōu)勢菌株，以期為姬松茸的進(jìn)一步綜合開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的4 株姬松茸由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心保藏。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，批號(hào) CMCC63501）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，批號(hào)ATCC-25925）、大腸埃希菌（Escherichia coli，批號(hào)ATCC-25922）、白色念珠菌（Candida albicans，批號(hào) CMCC85021），以上4 種菌株由陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種保藏中心提供，試驗(yàn)前復(fù)蘇傳代使用。

維生素 C（VC，分析純，批號(hào)：20160105）：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；DPPH：Sigma 公司；ABTS：上海生工生物工程有限公司；其余試劑均為分析純：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

馬鈴薯瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氫鉀5.0 g/L、硫酸鎂3.0 g/L、瓊脂15.0 g/L、水1 000 mL、pH 值自然。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3.0 g、磷酸氫二鉀1.0 g、七水合硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.5 g、氯化鉀 0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖 30.0 g、瓊脂 15.0 g、蒸餾水 1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸粉3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，瓊脂 15 g/L，水 1 000 mL。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELA N1000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛郎儀器有限公司；SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺(tái)：上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV2550 型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株菌落及細(xì)胞形態(tài)

分別將4 株姬松茸菌株接種于察氏培養(yǎng)基上，28 ℃暗培養(yǎng)5 d，觀察其菌落形態(tài)，采用棉藍(lán)染色法[14]在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲體的形態(tài)和大小[15]。

1.3.2 菌株ITS分子鑒定

對(duì)4 株姬松茸菌株進(jìn)行ITS 分子鑒定，利用CTAB 法提取4 株姬松茸菌株的DNA，采用真菌通用引物 ITS-1（5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS-4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對(duì) ITS 序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系 50 μL：2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各 2 μL，模板 DNA1 μL（濃度 10 ng/μL），雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃ 60 s，33 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。將試驗(yàn)陽性PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，測序結(jié)果整理后提交National Center for Biotechnology Information 數(shù)據(jù)庫，申請(qǐng)并獲得登錄號(hào)，并利用blast 進(jìn)行序列比對(duì)，下載相似序列后利用Mega7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 胞外多糖提取及含量測定

將4 株姬松茸菌株接入150 mL PDA 液體培養(yǎng)基中，120 r/min 振蕩發(fā)酵7 d，抽濾，收集濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至60 mL，采用Sevag 法去除蛋白質(zhì)，濾液與Sevag試劑按3 ∶1（體積比）置于250 mL 三角瓶中120 r/min振蕩30 min，分液漏斗靜置20 min，重復(fù)3 次，取上層清液。真空濃縮至50 mL，轉(zhuǎn)入三角瓶中加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min 離心 10 min，45 ℃干燥至恒重，即得姬松茸胞外多糖[16]。首先取除蛋白質(zhì)后上層清液采用苯酚-濃硫酸法[17]測定總糖含量，并作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=28.529x-0.001 9，R2=0.993 9。然后取加入乙醇沉降并離心后的上清液利用DNS 法測定還原糖含量，兩者之差即為胞外多糖的含量[18]，計(jì)算公式如下：

1.3.4 抑菌活性分析

采用濾紙片擴(kuò)散法[19]研究4 株姬松茸胞外多糖（各取50 μL）對(duì)指示菌-枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus、大腸桿菌Escherichia coli、白色念珠菌Candida albicans 菌株的抑菌效果，以含無菌PDA 培養(yǎng)基50 μL 的紙片作為溶劑陰性對(duì)照，以含 25 μg/mL 青霉素 50 μL 的紙片作為陽性對(duì)照，以0.96%生理鹽水100 μL 的紙片為空白對(duì)照。利用十字交叉法測量抑菌圈直徑D，抑菌效果（E）按下列公式計(jì)算：

采用二倍連續(xù)梯度稀釋法測定最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），以 0.5 mL 的生理鹽水為空白對(duì)照，同時(shí)采用平板轉(zhuǎn)種法[20]測定最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）。

1.3.5 α-淀粉酶抑制作用的測定

參考文獻(xiàn)[21-22]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL溶液，取0.5 mL 樣品溶液，加入0.5 mL 1 U/mL 的α-淀粉酶溶液與1 mL 0.25%的淀粉溶液，混勻后于50 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min。然后立即加入1 mL DNS 溶液，沸水浴加熱5 min，冷卻后用pH 6.6 磷酸緩沖液定容至10 mL，測定575 nm 處吸光值。每樣重復(fù)3 次，取平均值，按下列公式計(jì)算α-淀粉酶活性的抑制率：

式中：AS為 0.5 mL 樣品液 +0.5 mL α-淀粉酶溶液的樣品吸光值；ASB為0.5 mL 樣品+0.5 mL 磷酸緩沖液的樣品對(duì)照組吸收值；AC為0.5 mL 二甲基亞砜+1 mL磷酸緩沖液的空白對(duì)照組吸光值。

1.3.6 體外抗氧化活性

1.3.6.1 還原能力測定

參考文獻(xiàn)[23]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品及 VC配成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 不同濃度的樣品溶液，取1mL 樣品，加入1mLpH6.6 磷酸緩沖液，1 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，加入1 mL10%三氯乙酸，混勻后取2 mL，加超純水 2 mL 與 200 μL 0.1%三氯化鐵，5 000 r/min 離心5 min，取上清液測定OD700，同時(shí)將鐵氰化鉀溶液替換成1 mL 去離子水作為對(duì)照組。以VC作為陽性對(duì)照，重復(fù)3 次，取平均值。

1.3.6.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[24]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品及 VC配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，取2 mL 樣品溶液加入1 mL 0.2 mmol/L DPPH-99.9%乙醇溶液，混勻，放置在室溫（25 ℃）暗處 10 min，5 000 r/min 離心 5min，取上清液測定517 nm 處吸光值，以VC為陽性對(duì)照，每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按下列公式計(jì)算DPPH 自由基清除率：

式中：AS為2 mL 樣品液+1 mL DPPH-乙醇溶液的樣品吸光值；ASB為2 mL 樣品液+1 mL 99.9 %乙醇溶液的樣品對(duì)照組吸光值；AC為2 mL 二甲基亞砜+1 mL 99.9%乙醇溶液的空白對(duì)照組吸光值。

1.3.6.3 ABTS+自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[25-26]，稍作修改，將7 mmol/L 的ABTS溶液和2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液等體積混合，在室溫（25 ℃）、避光條件下靜置過夜，形成ABTS+儲(chǔ)備液。使用前將ABTS+儲(chǔ)備液用99.9 %乙醇稀釋（約稀釋60 倍），即 OD734為0.7±0.02。用無菌水將4 種胞外多糖樣品和 VC配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的樣品溶液，取1 mL 樣品溶入2 mL ABTS+工作液，振蕩混合，放置于暗處5 min 后5 000 r/min 離心5 min，取上清液測定OD734，VC為陽性對(duì)照。每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按下列公式計(jì)算ABTS+自由基清除率：

式中：AS為 1 mL 樣品液+2 mL ABTS+工作液的樣品吸光值；ASB為1 mL 樣品+2 mL 99.9%乙醇溶液的樣品對(duì)照組吸收值；AC為1 mL 二甲基亞砜+2 mL 99.9%乙醇溶液的空白對(duì)照組吸光值。

1.3.6.4 羥自由基清除能力的測定

參考文獻(xiàn)[27]，稍作修改，用無菌水將4 種胞外多糖樣品及 VC配制成 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 溶液，在1 mL 樣品中分別加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各2 mL 最后加2 mL 1.2 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，于 37 ℃反應(yīng) 30 min，5 000 r/min 離心 5 min，取上清液以去離子水調(diào)零在波長510 nm 測定樣品濃度吸光度A1；另外，去離子水代替H2O2重復(fù)上述操作，測定兩樣品本身的吸光值A(chǔ)2，同時(shí)以水代替兩樣品溶液，測定吸光度A0。VC為陽性對(duì)照。每樣重復(fù)3 次，取平均值，并按下列公式計(jì)算羥自由基清除率：

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用SPSS22.0，Origin8.5 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表制作等，結(jié)果取3 次平行試驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株菌落形態(tài)

菌株外觀形態(tài)與顯微特征圖見圖1。

圖1 菌株外觀形態(tài)與顯微特征圖Fig.1 Colony morphology and microscopic characteristic of strains

4 株姬松茸菌絲有隔膜，具鎖狀分枝彎曲，與次頂端細(xì)胞融合，形成一橋狀結(jié)構(gòu)。菌絲呈白色，呈扇面狀，背面呈淡黃色。4 株姬松茸菌株呈現(xiàn)不同的菌落形態(tài)，JS01 和JS06 氣生菌絲較為發(fā)達(dá)，生長速度快，生長后期能夠擰結(jié)成束，而JS04 和JS05 以基生菌絲為主，生長速度較慢。

2.2 菌株ITS 分子鑒定

JS01、JS04、JS05 和 JS06 菌株 ITS 的擴(kuò)增結(jié)果顯示其序列大小在800 bp 左右。

將菌株ITS 序列測序后，提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行序列分析和相似性比較，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹以證實(shí)該菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，結(jié)果如圖2所示。菌株與Agaricus blazei 中的ITS 序列具有99%的高度相似性，同時(shí)結(jié)合菌株菌落形態(tài)及顯微特征結(jié)果認(rèn)為，菌株 JS01、JS04、JS05 和 JS06 為姬松茸菌株。

2.3 胞外多糖含量測定

采用苯酚-濃硫酸法和DNS 法測定4 株姬松茸胞外多糖含量見表1。

圖2 4 株姬松茸菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 4 Agaricus blazei strains

表1 胞外多糖含量Table 1 Extracellular polysaccharide content of strains

如表1所示，各姬松茸菌株的胞外多糖含量有所差異，其中JS01 胞外多糖含量為8.50 mg/mL，JS04 為3.34 mg/mL，JS05 為 8.81 mg/mL，JS06 為 7.70 mg/mL。

2.4 抗菌活性分析結(jié)果

本試驗(yàn)利用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)4 株姬松茸胞外多糖的抗菌活性進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見表2。

表2 胞外多糖抗菌活性分析Table 2 Antibacterial activity analysis of extracellular polysaccharide

菌株 JS01、JS04 的胞外多糖對(duì) Escherichia coli 這種革蘭氏陰性菌有微弱的抑制作用，抑菌圈的大小為8 mm～12 mm，但 JS06 的胞外多糖對(duì) Staphylococcus aureus 和Escherichia coli 均有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈大小為21 mm～28 mm。4 株姬松茸胞外多糖對(duì)病原菌Staphyloccocus aureus 均具有一定的抑制作用。上述研究表明，JS06 胞外多糖在抑制病原菌方面效果更好。

2.5 抑菌活性對(duì)比

胞外多糖的MIC 和MBC 結(jié)果見表3。

試驗(yàn)對(duì)照組無菌水紙片周圍無抑菌環(huán)，陽性對(duì)照組0.5%碘伏溶液周圍抑菌環(huán)均＞1.5 cm，表明試驗(yàn)方法可行且無誤。結(jié)果表明，4 株姬松茸的胞外多糖對(duì)Bacillus subtilis、Staphyloccocus aureus、Escherichia coli和Candida albicans 均有一定的抑制作用，4 種姬松茸菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較好，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果差距不大；試驗(yàn)表明菌株JS06 有更好抑菌活性，而對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果明顯優(yōu)于其他兩株致病菌，其最小抑菌濃度分別為0.31 g/L 和0.77 g/L，最小殺菌濃度為0.39 g/L 和0.94 g/L。

表3 胞外多糖的MIC 和MBCTable 3 MIC and MBC of extracellular polysaccharide

2.6 α-淀粉酶抑制能力測定

胞外多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用見圖3。

圖3 胞外多糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of extracellular polysaccharide on α-Amylase

由圖3 可以看出，4 株姬松茸胞外多糖成分對(duì)α-淀粉酶均有一定的抑制作用。濃度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL 內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，α-淀粉酶抑制率不斷增加時(shí)，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL 時(shí)，對(duì)α-淀粉酶的抑制率分別為93.55%、81.44%、89.46%和91.79%。經(jīng)回歸分析得JS01 胞外多糖成分回歸方程為：y=9.539 8x+26.862（R2=0.998 8），計(jì)算得 IC50為 2.425 mg/mL；JS04 胞外多糖成分回歸方程為：y=10.95x+3.388 5（R2=0.997 2），計(jì)算得IC50為4.257 mg/mL；JS05 胞外多糖成分回歸方程為：y=9.756 2x+21.572（R2=0.999 3），計(jì)算得 IC50為2.905 mg/mL；JS06 胞外多糖成分回歸方程為：y=10.869x+17.854（R2=0.991 0），計(jì)算得 IC50為 2.958 mg/mL，表明4 株姬松茸胞外多糖成分對(duì)α-淀粉酶抑制作用存在較大差異，JS01 對(duì)α-淀粉酶抑制效果明顯優(yōu)于其他3 株姬松茸菌株。

2.7 體外抗氧化活性對(duì)比

2.7.1 還原能力測定

胞外多糖的還原能力見圖4。

圖4 胞外多糖的還原能力Fig.4 Reducing activity of extracellular polysaccharide

由圖4 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分均表現(xiàn)出不同程度的還原能力，與陽性對(duì)照VC相比，還原力從大到小排序?yàn)?VC＞JS01＞JS06＞JS05＞JS04。還原能力隨濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，4 株姬松茸胞外多糖的還原能力大小無顯著差異，但當(dāng)大于0.1 mg/mL 時(shí)，四者的還原能力差距逐漸變大。當(dāng)濃度為 1.0 mg/mL 時(shí)，VC和菌株 JS01、JS06、JS05、JS04 的還原力分別為 0.70±0.05 和 0.53±0.04、0.52±0.02、0.50±0.04、0.41±0.03，表明JS04 胞外多糖成分還原能力明顯小于其他3 株姬松茸菌株，4 株姬松茸胞外多糖都小于VC的還原能力。

2.7.2 DPPH 自由基清除能力的測定

胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用見圖5。

圖5 胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.5 DPPH free radicals scavenging activity of extracellular polysaccharide

由圖5 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，0.1 mg/mL～1.0 mg/mL內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH 自由基清除能力不斷增強(qiáng)，呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。DPPH 自由基清除能力從大到小排序?yàn)?VC＞JS06＞JS01＞JS05＞JS04，濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，對(duì)DPPH 自由基清除率分別為98.33%、96.47%、68.62%、45.75%和37.42%，經(jīng)回歸分析得VC回歸方程為：y=10.007x+25.484（R2=0.983 8），計(jì)算得EC50為2.449 mg/mL；JS06 多糖成分回歸方程為：y=17.928x-33.145（R2=0.985 0），計(jì)算得 EC50為 4.638 mg/mL；JS01 多糖成分回歸方程為：y=11.292x-13.442（R2=0.988 6），計(jì)算得 EC50為 5.618 mg/mL；JS05 多糖成分回歸方程為：y=6.652 5x-1.204 3（R2=0.997 3），計(jì)算得EC50為7.697 mg/mL；JS04 多糖成分回歸方程為：y=5.543 4x-2.579 3（R2=0.985 2），計(jì)算得 EC50為 9.486 mg/mL。半數(shù)有效濃度（median effective concentration，EC50）是指清除率為50%時(shí)的樣品質(zhì)量濃度，一般認(rèn)為某種物質(zhì)的EC50值低于10 mg/mL，表明其具有較好的抗氧化性[28]，因此4 株姬松茸胞外多糖成分均有較好的DPPH 自由基清除能力且存在顯著差異，JS06 胞外多糖的清除能力顯著優(yōu)于其他3 株姬松茸的胞外多糖，表明JS06 的胞外多糖成分具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。任朝輝等研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸菌絲體多糖對(duì)DPPH 自由基的EC50為0.184 mg/mL，清除DPPH 自由基能力顯著大于胞外多糖，這可能與多糖本身活性和濃度有關(guān)，這有待于后續(xù)試驗(yàn)的驗(yàn)證。

2.7.3 ABTS+自由基清除能力的測定

胞外多糖對(duì)ABTS+自由基的清除作用見圖6。

圖6 胞外多糖對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.6 ABTS+free radicals scavenging activity of extracellular polysaccharide

由圖6 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分均具有較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，隨著其質(zhì)量濃度的增加，清除作用也隨之增強(qiáng)。ABTS+自由基清除能力從大到小排序?yàn)閴K VC＞JS01＞JS05＞JS06＞JS04，濃度為 1.0 mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+自由基清除率分別為93.65%、83.06%、80.30%、77.27%和65.71%，經(jīng)回歸分析Vc 和4 株姬松茸菌株的 EC50值依次為 2.163、3.203、3.647、3.708 mg/mL 和5.046 mg/mL，表明4 株姬松茸菌株胞外多糖成分對(duì)ABTS+自由基清除能力存在較大差異，JS01 的清除能力明顯優(yōu)于其他3 株姬松茸菌株。說明JS01 的胞外多糖成分具有更強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。

2.7.4 羥自由基清除能力的測定

胞外多糖對(duì)羥自由基的清除作用見圖7。

圖7 胞外多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.7 Hydroxyl free radical scavenging activity of extracellular polysaccharide

由圖7 可知，4 株姬松茸胞外多糖成分和VC均具有明顯的清除羥自由基作用且隨著質(zhì)量濃度的增加不斷增加，對(duì)羥自由基的清除能力也逐漸增強(qiáng)。羥自由基清除能力從大到小排序?yàn)镴S06＞JS01＞VC＞JS05＞JS04，濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，對(duì)羥自由基清除率分別為99.71%、99.48%、99.03%、97.80%和94.25%。表明4株姬松茸菌株胞外多糖成分對(duì)羥自由基清除能力存在較大差異，JS06 和JS01 的清除能力優(yōu)于VC，且明顯優(yōu)于其他2 株姬松茸菌株。說明JS06 和JS01 的胞外多糖成分具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力，張卉等[29]研究發(fā)現(xiàn)姬松茸胞外多糖AbEXP-la 在30 mg/L 的濃度條件下對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)32.74%，這與本試驗(yàn)的結(jié)果類似。

3 結(jié)論

4 株姬松茸菌株對(duì)4 種致病菌的均有一定抑制效果，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好，表明菌株JS06有更好抑菌活性，可為天然抗菌藥物的開發(fā)提供新材料。

抗氧化結(jié)果顯示4 株姬松茸胞外多糖均具有一定的抗氧化活性，當(dāng)濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，JS01 的還原能力為 0.53±0.04，相當(dāng)于 0.76 mg/mL VC當(dāng)量。JS06 對(duì)于DPPH 自由基和羥自由基的清除率分別為96.47%和99.71%，均高于其他3 株姬松茸菌株，且對(duì)于羥自由基的清除率高于VC；菌株JS01 對(duì)α-淀粉酶的IC50為2.425 mg/mL，明顯優(yōu)于其他3 株姬松茸菌株的抑制作用。由此可見，4 株姬松茸胞外多糖均具有抑菌、抗氧化活性和α-淀粉酶抑制作用，表明其胞外多糖具有潛在的藥用價(jià)值，有利于加大對(duì)姬松茸的研究力度，對(duì)姬松茸種質(zhì)資源的開發(fā)利用具有重要意義。4 株姬松茸菌株中JS01 和JS06 的綜合表現(xiàn)較好，值得進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)未對(duì)提取得到的胞外多糖進(jìn)行脫色和進(jìn)一步的純化處理，這可能會(huì)對(duì)其生物活性有一定影響，需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，并提出有效解決方案，以便在不破壞胞外多糖活性的前提下，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的脫色和純化。