玉米須中不同極性多酚體外抗氧化活性比較研究

關(guān)海寧，刁小琴，喬秀麗，李楊，劉麗美

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061）

人體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生具有強氧化性的活性氧和自由基等物質(zhì)，這些物質(zhì)若未能及時清除，會對生物膜及細(xì)胞功能等造成損傷，進(jìn)而引發(fā)衰老、心血管疾病及癌癥的發(fā)生[1-2]。研究表明，抗氧化劑具有明顯清除自由基的能力，進(jìn)而減少其對人體的危害[3-4]。然而，由于人工合成的抗氧化劑存在安全隱患，因此，開發(fā)低毒、安全、高效的天然抗氧化劑已成為研究的熱點[5-6]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，酚類化合物是植物組織中廣泛存在的重要的次級代謝產(chǎn)物，具有抗衰老、抗氧化、抗炎癥、抗癌、抗腫瘤和抗心血管疾病等多種生理功能[7-9]，從而引起了國內(nèi)外研究者極大的興趣。目前，關(guān)于多酚抗氧化活性研究中存在的主要問題是提取物純度較低，強效多酚含量較少，有相關(guān)研究表明[10-12]不同極性的溶劑可以實現(xiàn)不同極性多酚的提取分離，從而篩選出強效多酚。

玉米須來源豐富、價格低廉、含有多糖、多酚、黃酮、綠原酸等多種活性成分，作為藥用資源具有廣闊的發(fā)展前景。試驗采用不同極性溶劑對玉米須多酚粗提液進(jìn)行分離，并通過5 種抗氧化體系對不同極性玉米須多酚進(jìn)行了抗氧化活性比較，并且分析了總多酚含量與5 種抗氧化檢測方法的相關(guān)性，該研究為開發(fā)天然無毒的抗氧化劑提供了理論參考，對玉米副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

玉米須：采自綏化市田間，干燥，粉碎，過30 目篩，備用。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量：99%）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；福林酚試劑：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical，DPPH）（分析純）：美國 sigma 公司；2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）[Diammoni um 2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]：湖南匯百特生物科技有限公司；乙酸乙酯（分析純）：無錫市晶科化工有限公司；石油醚（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯仿（分析純）：天津市康科德科技有限公司；正丁醇（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；KQ-200VDE 雙頻數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；85-2 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海梅香儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；80-2B 臺式離心機(jī)：湖南星科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同極性玉米須多酚的提取分離

稱取玉米須樣品5 g，加50 %的乙醇，料液比1 ∶20（g/mL），于超聲溫度 50 ℃、超聲功率 200 W 的條件下超聲提取30 min，離心（或抽濾）得濾液，濾渣重復(fù)提取2 次，合并濾液，減壓蒸干，定容至25 mL，即為玉米須多酚粗提物。

向25 mL 多酚粗提液中加入等體積的石油醚，磁力攪拌30 min 后，于分液漏斗中分層，得石油醚層和水層；在水層中加入等體積的氯仿，得氯仿層和水層；利用上述方法，在水層中依次加入等體積乙酸乙酯和正丁醇，分別得到乙酸乙酯層，正丁醇層和水層。每種溶劑萃取各重復(fù)3 次，合并各極性部位的萃取液，石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層分別利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行減壓濃縮去除有機(jī)溶劑，減壓后不同極性萃取物加50%乙醇定容至25 mL，備用。

1.3.2 不同極性多酚含量的測定

采用福林酚比色法測定[13]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在最大吸收波長760 nm 處測不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1 mL 不同極性的萃取物，在同樣的條件下測定不同樣品的吸光度值，計算各極性萃取物中多酚的含量，結(jié)果以各極性萃取物中含有相當(dāng)沒食子酸的毫克數(shù)表示（mg/g）。

1.3.3 抗氧化能力的測定

還原能力的測定，采用吸光值法[14]；1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基清除能力的測定，參照Atoui等[15]的方法；超氧自由基清除能力的測定，參照Xiang等[16]的方法；羥自由基清除能力的測定參照Chen 等[17]的方法；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）自由基清除能力的測定，參照Re 等[18]的方法測定。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與相關(guān)性分析

所有試驗均重復(fù)3 次，計算結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 2010 作圖，差異顯著性分析采用Statistix 8.0 軟件及相關(guān)性分析采用SPSS 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米須多酚含量的測定

2.1.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

以沒食子酸濃度（μg/mL）對吸光度y 進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為y=0.117 1x+0.041 4，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1，由圖可知，線性相關(guān)性良好。

2.1.2 不同極性玉米須多酚的含量

溶劑萃取法是一種分級純化方法，根據(jù)溶劑與提取物極性相似相溶的原理，將目標(biāo)物從植物組織中萃取出來。玉米須中多酚成分較為復(fù)雜，采用極性不同的有機(jī)溶劑可以將不同極性的多酚萃取分離，結(jié)果見表1。

表1 不同極性玉米須多酚的含量Table 1 Phenolic contents of corn silk with different polarities

表1 看出，溶劑極性的變化對總酚含量影響較大，水層的總酚含量顯著高于其它有機(jī)層（p<0.05），而非極性溶劑石油醚層的總酚含量最低，說明玉米須多酚以極性酚為主，極性酚與弱極性酚含量具有顯著差異（p<0.05）。也有研究也表明地參多酚和紅棗多酚也均以極性酚為主[6，12]，這與本研究的結(jié)果相一致。食品功能成分研究的關(guān)鍵不是提取出更多的成分，而是得到更多具有高活性的功能成分。因此在采用不同極性溶劑分離多酚的同時，還應(yīng)考慮各極性酚的抗氧化活性，便于后續(xù)具有強抗氧化多酚的分離純化。

2.2 不同極性相提取物抗氧化活性分析

2.2.1 不同極性多酚的還原能力比較

還原力的測定是評價化合物抗氧化能力的一個重要指標(biāo)，還原力越強，抗氧化能力越強。不同極性多酚的還原能力見圖2。

圖2 看出，不同極性的多酚，其還原能力各不相同。其中，水層相的還原能力最強，顯著高于其他溶劑的提取物（p<0.05），而非極性的石油醚層的還原能力顯著低于其他溶劑的提取物（p<0.05），說明玉米須中極性酚的抗氧化能力較強。

2.2.2 不同極性多酚的DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基是測定樣品具有抗氧化作用的一種穩(wěn)定的自由基，若其能被待測物清除，則說明該待測物具有打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的能力[19]，清除率越高，抗氧化能力越強。不同極性多酚的DPPH 自由基清除能力見圖3。

圖2 不同極性多酚的還原能力Fig.2 Reducing ability of corn silk polyphenols with different polarities

圖3 不同極性多酚的DPPH 自由基清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

圖3 可知，隨著萃取溶劑極性的增強，提取物的DPPH 自由基清除能力顯著增強（p<0.05），其中水層DPPH 自由基清除率達(dá)到82.3%，其次為正丁醇層，而乙酸乙酯層相對較弱，石油醚層最弱，清除能力只有17.8%。由此可知玉米須多酚水層提取物對DPPH 自由基具有很強的清除作用，這與還原能力的順序一致。

2.2.3 不同極性多酚的超氧自由基清除能力

超氧自由基是生命體代謝過程中產(chǎn)生的一種氧化能力較強的自由基，能夠加快人體衰老進(jìn)程，誘發(fā)各種疾病，危害人體健康。不同極性玉米多酚的超氧自由基的清除能力見圖4。

圖4 可知，水層對超氧自由基的清除能力最強，清除率達(dá)到52.4%，正丁醇次之為36.4%，乙酸乙酯層與氯仿層分別為23.8%和20.0%，而石油醚層最弱，清除能力僅為水層的25%。由此可見，不同極性多酚的超氧自由基的清除能力與極性呈正相關(guān)。

圖4 不同極性多酚的超氧自由基清除能力Fig.4 Superoxide anion radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

2.2.4 不同極性多酚的羥基自由基清除能力

羥基自由基是一種活性氧自由基，具有極強的氧化能力。人體內(nèi)若有較多的羥基自由基，容易引發(fā)組織細(xì)胞病變，各種疾病的發(fā)生以及加速機(jī)體的衰老，因此對羥基自由基的清除作用是評價抗氧化物質(zhì)能力高低的一個重要指標(biāo)。不同極性多酚的羥自由基清除能力見圖5。

圖5 不同極性多酚的羥自由基清除能力Fig.5 Hydroxyl radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

圖5 看出，不同極性溶劑的玉米須提取液對羥基自由基的清除率有顯著差異（p<0.05）。極性強的溶劑清除率高，極性弱的溶劑清除率低，非極性的溶劑清除率最低。水層的羥基自由基清除率為69.57%，其次是正丁醇層為60.12%，而乙酸乙酯層與氯仿層顯著低于水層和正丁醇層（p<0.05），但二者抗氧化能力相當(dāng)。非極性石油醚層的羥基自由基清除能力最弱，與上述DPPH 自由基清除能力、超氧自由基清除能力研究結(jié)果基本一致。

2.2.5 不同極性多酚的ABTS+自由基清除能力比較

ABTS 是一種供氫體，它與過硫酸鉀反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基ABTS+·，清除ABTS+·的方法被作為一種測定物質(zhì)體外抗氧化能力的新方法。不同極性多酚的ABTS+自由基清除能力見圖6。

圖6 不同極性多酚的ABTS 自由基清除能力Fig.6 ABTS radical scavenging ability of corn silk polyphenols with different polarities

圖6 可以看出，水層、正丁醇層、乙酸乙酯層以及氯仿層中的極性多酚萃取物清除ABTS+自由基能力具有顯著差異（p<0.05），以水層最高，為47.23%，而非極性石油醚層提取物的清除能力最低，為9.5%，但與弱極性層氯仿差異不顯著（p＞0.05）。

2.3 相關(guān)性分析

對玉米須不同極性多酚的酚含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2 不同極性玉米須多酚抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of antioxidant activity of corn silk polyphenols with different polarities

表2 看出，總酚含量與還原力、DPPH 自由基和超氧自由基的清除能力呈顯著相關(guān)性（p<0.05），而與羥基自由基和ABTS+自由基清除能力無顯著的相關(guān)性，說明這兩種體系中，除了多酚類物質(zhì)外，提取物中還存在非酚類化合物對羥基自由基和ABTS+自由基也具有一定的清除能力。不同的抗氧化體系間，還原力與DPPH 自由基、超氧自由基、羥基自由基和ABTS+自由基的清除能力呈極顯著相關(guān)性（p ＜0.01），DPPH 自由基和超氧自由基和ABTS+自由基的清除能力相關(guān)性極顯著（p ＜0.01），與羥基自由基的清除能力相關(guān)性顯著（p ＜0.05）。羥基自由基清除能力與ABTS 自由基清除能力間無顯著相關(guān)性。綜合看來，不同的抗氧化體系之間并不都呈顯著正相關(guān)，這可能是由于不同檢測方法的反應(yīng)機(jī)理稍有差異所致。

3 結(jié)論

隨著萃取溶劑極性的增加，玉米須多酚含量逐漸升高，即水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層＞氯仿層＞石油醚層，表明玉米須多酚中強極性多酚含量高于弱極性多酚含量。

由于不同抗氧化檢測方法的反應(yīng)機(jī)理不同，為獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究利用還原力、DPPH 自由基清除法、羥基自由基清除法、超氧自由基清除法、ABTS+自由基清除法對不同極性溶劑萃取得到的多酚抗氧化能力進(jìn)行了比較。5 種評價體系得出不同極性的多酚，抗氧化活性表現(xiàn)出一定的差異，這可能由于不同極性溶劑提取物中起抗氧化作用物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同[20]，但抗氧化能力的順序一致，即水層＞正丁醇層＞乙酸乙酯層＞氯仿層＞石油醚層，總體來說，水層提取物的抗氧化能力最強。為獲得較高抗氧化活性的玉米須多酚，可以先除去提取物中的弱極性部位，富集抗氧化活性最強的水層多酚，這可為高抗氧化活性多酚的組成分析及分離鑒定奠定基礎(chǔ)。