紅外光譜分析技術(shù)測定飼料營養(yǎng)品質(zhì)及其分子結(jié)構(gòu)的研究進展

徐 淼，景寒松，楊桂芹

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866）

飼料是畜牧生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，檢測飼料的化學(xué)組成、消化特性，評估其營養(yǎng)價值，進而對飼料產(chǎn)品質(zhì)量進行控制，是飼料生產(chǎn)過程中的重要環(huán)節(jié)。但飼料養(yǎng)分的利用率、消化降解和代謝特征不僅與傳統(tǒng)動物營養(yǎng)學(xué)所重點關(guān)注的養(yǎng)分化學(xué)組成有關(guān)，而且在很大程度上還受飼料養(yǎng)分的理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)及飼料本身的組織結(jié)構(gòu)等影響[1-3]。以飼料常規(guī)養(yǎng)分分析、消化性能評定等數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過應(yīng)用紅外光譜（Infrared Reflection Spectroscopy，IRS）分析技術(shù)建立數(shù)據(jù)模型（單變量、多變量分析）的方式，可揭示飼料養(yǎng)分的光譜分子結(jié)構(gòu)與其營養(yǎng)特性間的關(guān)系[4-5]。本文綜述了利用IRS 技術(shù)在飼料及飼料原料營養(yǎng)價值評定、營養(yǎng)元素分子結(jié)構(gòu)解析及其與營養(yǎng)特性相關(guān)性分析方面的研究進展，并對影響IRS 分析技術(shù)測定準確性的因素及在飼料工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用前景進行了闡述，為豐富飼料營養(yǎng)價值評定理論與技術(shù)提供參考。

1 IRS 分析技術(shù)在飼料營養(yǎng)價值評估上的應(yīng)用原理

樣品中的分子吸收一定能量后，引起分子的振動從低能級振動狀態(tài)向相鄰的高能級躍遷，這種躍遷總是發(fā)生在紅外光區(qū)，因此稱作IRS。分子的紅外吸收光譜屬于帶狀光譜，獲得IRS 的基本方式是漫反射和漫透射方式。因此，IRS 通常是以波長（nm）或波數(shù)（cm-1）為橫坐標（吸收峰的位置），以反射光強度或其他隨波長變化的性質(zhì)（透射率或吸光度）為縱坐標，得到反映紅外光與物質(zhì)相互作用的圖譜[6]。紅外光譜根據(jù)波長區(qū)間可分為近紅外（NIR：波數(shù)12 820～4 000 cm-1）、中紅外（MIR：波數(shù)4 000～400 cm-1）和遠紅外（FIR：波數(shù)400～10 cm-1）區(qū)[7]。在飼料行業(yè)中，主要應(yīng)用NIR與MIR 技術(shù)，其中，NIR 技術(shù)主要應(yīng)用于飼料原料及飼料中有機成分的定量分析以及飼料原料摻假與否的定性判別，MIR 技術(shù)主要檢測飼料或飼料原料中相應(yīng)成分的分子結(jié)構(gòu)組成，從而從分子結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)價值回歸層面評價飼料或飼料原料的營養(yǎng)特性[8-10]。MIR 光譜區(qū)樣品中分子的化學(xué)鍵可吸收紅外光輻射，得出的IRS 可用于鑒別化合物的化學(xué)鍵類型，進而對化合物分子結(jié)構(gòu)進行推測。組成不同物質(zhì)（樣品）的各種分子基團，如O-H、N-H、C-H、S-H 和C=O 等都有特定的吸收區(qū)域。當有機物分子受到紅外光線照射時產(chǎn)生共振，同時光的能量一部分被吸收，通過測量其吸收光可得到極為復(fù)雜的圖譜。圖譜中的峰數(shù)、峰位和峰強與樣品中組分的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此被測飼料樣品的光譜特征是多種組分吸收光譜的綜合表現(xiàn)[3,11-12]。FIR 技術(shù)主要應(yīng)用于中藥學(xué)、生物化學(xué)方面，對核酸、蛋白質(zhì)等進行分析[13]。目前，IRS 分析技術(shù)已成為飼料行業(yè)日常品控中較為成熟和常用的分析工具。

2 傳統(tǒng)的飼料營養(yǎng)價值評定技術(shù)與IRS 分析技術(shù)

傳統(tǒng)的飼料營養(yǎng)價值評定一般采用濕化學(xué)分析方法和動物試驗（體內(nèi)、體外）進行。濕化學(xué)分析方法是以物質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)測定含量，通常會破壞飼料的固有分子結(jié)構(gòu)，并經(jīng)常影響飼料營養(yǎng)評估的結(jié)果[14]；動物飼養(yǎng)或消化代謝試驗不僅受試驗條件（試驗動物、試驗周期和環(huán)境等）影響，而且成本高，很難在日常生產(chǎn)中進行測定。而IRS 分析技術(shù)能夠以超高空間分辨率揭示生物組織的分子結(jié)構(gòu)，為快速準確評定飼料的營養(yǎng)價值提供了有效工具。由表1 可知，在飼料營養(yǎng)價值評定方面，IRS 分析技術(shù)必須以傳統(tǒng)方法測定的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，才能對未知樣品進行預(yù)測；同時在飼料分子結(jié)構(gòu)測定、檢測速度等方面，IRS 技術(shù)具有傳統(tǒng)方法沒有的優(yōu)勢。只有二者有機結(jié)合起來，才能相得益彰。

3 利用IRS 分析技術(shù)測定飼料蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)與其營養(yǎng)特性的關(guān)系

飼料蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征是評價蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的重要信息和依據(jù)。近些年來，應(yīng)用IRS 分析技術(shù)在蛋白質(zhì)飼料的品質(zhì)分析、摻假溯源等方面已經(jīng)進行了大量卓有成效的工作[15]。IRS 分析技術(shù)主要針對蛋白質(zhì)分子振動（化學(xué)鍵的伸縮、扭曲和旋轉(zhuǎn)等）產(chǎn)生的吸收光譜特征，研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成[16]。蛋白質(zhì)紅外吸收光譜由9 個特征吸收帶組成。其中，酰胺I 帶（Amide-I，波數(shù)1 700～1 600 cm-1）和酰胺II 帶（Amide-II，波數(shù)1 600～1 500 cm-1）是蛋白質(zhì)紅外吸收光譜中2 個主要功能波段[17-18]。酰胺I 帶主要對與肽鍵（-CONH-）有關(guān)的H 鍵敏感，由80% 的C=O 和20% 的C-N 伸縮振動組成[19]；酰胺II 帶主要由60% 的N-H 彎曲振動和40%的C-N 伸縮振動組成[17]。根據(jù)這2 個波段的吸收峰高度和面積變化，可推測臨近基團或化學(xué)鍵的類型，進而確定蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征信息[20]。

白明昧[11]應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectrometry，F(xiàn)TIS）儀定量分析了豆粕、魚粉、玉米DDGS、玉米蛋白粉和天然羽毛粉中蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征，表明了α 螺旋/β 折疊是反映飼料原料蛋白質(zhì)體外消化率和溶解度的重要指標。吳鵬華[21]研究表明，DDGS 和豆粕混合飼料中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的改變與蛋白質(zhì)組分和瘤胃降解特性顯著相關(guān)，α-螺旋/β 折疊越高，瘤胃有效降解率越高，并且進一步證明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)能夠用來預(yù)測混合飼料的營養(yǎng)價值。王曉帆[22]對玉米青貯蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行研究得出，玉米青貯蛋白質(zhì)的酰胺帶的峰高和面積、α- 螺旋和β 折疊的峰高和面積等與飼料粗蛋白質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)含量及反芻動物干物質(zhì)和蛋白質(zhì)有效降解率等具有顯著的相關(guān)性。Yan 等[23]、Khan 等[24]和Peng 等[25]進一步研究得出，大麥的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的酰胺I 帶、酰胺Ⅱ帶以及α-螺旋的峰高度與反芻動物對中性洗滌纖維的降解率也有顯著的正相關(guān)關(guān)系[26]。以上研究為客觀評價飼料蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值和飼料蛋白質(zhì)源結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了重要的理論依據(jù)。

4 利用IRS 分析技術(shù)測定飼料碳水化合物的分子結(jié)構(gòu)與其營養(yǎng)特性的關(guān)系

碳水化合物（Carbohydrate，CHO）又稱糖類，在動物飼料組成中占50%以上，因此CHO 的性質(zhì)在飼料營養(yǎng)價值評定中占據(jù)重要位置。CHO 的IRS 吸收強度與其化學(xué)成分、分子結(jié)構(gòu)、瘤胃降解動力學(xué)和可利用養(yǎng)分含量等營養(yǎng)特性密切相關(guān)。因此，CHO 在MIR 光譜區(qū)的吸收特性可用于飼料的營養(yǎng)價值評定[27]。

如Xin 等[28]對比了芥類雙低菜粕（Carinata Meal）和菜籽粕在不同時間點的瘤胃降解殘渣CHO 光譜結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)2 種飼料48 h 瘤胃降解殘渣的光譜參數(shù)有很大差異。Yang 等[26]利用FTIS 技術(shù)測定了5 個品種大麥中的總CHO 和非淀粉CHO（β-葡聚糖、纖維素化合物）的分子結(jié)構(gòu)，明確了大麥的CHO 分子結(jié)構(gòu)特征與反芻動物蛋白質(zhì)的利用率具有顯著的相關(guān)性，而不是預(yù)期的CHO、淀粉的利用率。李欣新[10]研究表明，雙低菜籽粕和豆粕中的CHO 特征峰的吸收強度與瘤胃干物質(zhì)降解的參數(shù)存在相關(guān)性。解釋了飼料CHO 的分子結(jié)構(gòu)及飼料本身的組織結(jié)構(gòu)（不同類型CHO 之間、CHO 與蛋白質(zhì)等的結(jié)構(gòu)關(guān)系）影響著飼料養(yǎng)分的消化吸收。

表1 傳統(tǒng)的飼料營養(yǎng)價值評定技術(shù)和IRS 分析技術(shù)比較

淀粉是由D-葡萄糖單元聚合而成的多糖，是多數(shù)動物飼料的主要成分。動物對不同來源淀粉的消化性存在差異，淀粉的化學(xué)組分并不能夠充分揭示其對動物的營養(yǎng)價值，淀粉的內(nèi)部結(jié)構(gòu)對營養(yǎng)物質(zhì)的利用程度具有很大影響。IRS 可以反映組成淀粉的葡萄糖單元的分子結(jié)構(gòu)特征。波數(shù)1 200～800 cm-1為淀粉特征峰區(qū)域，在此區(qū)域內(nèi)包含C-O、C-C、C-H 的伸縮振動和C-OH 的彎曲振動。Yu[29]研究表明，在波數(shù)為860 cm-1和928 cm-1吸收峰區(qū)域的峰面積與飼料淀粉含量具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系（r 分別為0.94 和0.95）。Capron 等[30]指出，淀粉在波數(shù)995 cm-1區(qū)域的吸收峰面積越大，淀粉大分子羥基間的H 鍵作用力越強，淀粉酶的水解過程越困難。張琳[12]采用FTIS 技術(shù)測定并比較了主要能量飼料中淀粉的FTIS 特征，表明糙米和碎米淀粉在波數(shù)為860 cm-1和928 cm-1區(qū)域，IRS 吸收峰顯著偏高，這與其化學(xué)成分分析結(jié)果（糙米和碎米中淀粉含量最高）相一致。

5 影響IRS 分析技術(shù)測定準確性的因素

5.1 定標樣品數(shù)量、來源、成分含量與變異 需要大量樣品做參考校準儀器是IRS 分析的難點。要選擇有代表性的樣品，即定標樣品集中應(yīng)包含除待測成分以外所有的背景信息。用于定標的樣品數(shù)必須有足夠的變異才能保證定標集的穩(wěn)定性。這種差異必須是樣本數(shù)足夠（至少50 個樣品，通常以70～150 個樣品為宜）作為整體的內(nèi)在反映[31]。因此，在實際應(yīng)用中一般認為建立適配性較窄的模型需選擇50～100 個定標樣品[32]。根據(jù)樣本的品種、來源，可建立不同的定標數(shù)據(jù)庫。如對于棉籽粕，采集樣品時除了考慮數(shù)量和成分含量、變異外，還應(yīng)充分考慮品種、生長環(huán)境、加工方式、收獲季節(jié)等因素[33]。IRS 對有機物最敏感，飼料中主要有機組分都具有吸收特性。與C、O、N、S 等相連的H 化學(xué)鍵通過拉伸或彎曲在近紅外區(qū)所產(chǎn)生的振動是特有的，因此缺乏有機組分的化合物不能定標。對于無機物質(zhì)，可以通過對樣品中的有機含H 基團產(chǎn)生影響，使IRS 發(fā)生變化，進而實現(xiàn)其定性或定量分析[34]。

5.2 定標樣品的物理性狀 樣品粉碎粒度的大小、樣品分布和密度等也會對近紅外預(yù)測性能產(chǎn)生影響[35]。由于粒度不同影響樣品分布均勻性和光學(xué)表面性質(zhì)，所以會導(dǎo)致反射光分散進而改變樣品的近紅外光譜信息[36]。趙佳等[37]認為，常規(guī)養(yǎng)分分析和近紅外掃描樣品粒徑一致，可消除樣品粒度對IRS 預(yù)測準確性的影響。因此，在實際工作中定標及被測樣品采樣、制樣條件一致及樣品混合均勻是確保IRS 預(yù)測準確性的基本條件。此外，樣品的水分含量、表面顏色以及所含雜質(zhì)的不同都會影響IRS 分析技術(shù)的預(yù)測效果[38]。

5.3 化學(xué)分析數(shù)據(jù)準確性 近紅外模型的建立中，參比值（理化指標、有效成分指標）測定的準確性至關(guān)重要，選取最優(yōu)建模參數(shù)，才能得到預(yù)測性能最佳的模型。按照一定標準的濕化學(xué)方法分析得到的參比數(shù)據(jù)的準確性也是影響NIRS 測定結(jié)果的重要原因之一[35]。褚小立等[39]研究表明，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)準確性越高，建立模型的預(yù)測性能越好，對未知樣本的預(yù)測結(jié)果越精確。因此，對于定標和驗證樣品的理化值而言，其檢測一定要按照國際公認的標準或國標法進行，且每個樣品至少做2～3 個平行，以確保參比值的檢測結(jié)果的精準無誤。IRS 測定的準確性只與建立近紅外預(yù)測模型所用的基準一致，即基準方法的準確性較高，才能保證IRS 測定結(jié)果的準確性。因此，定標數(shù)據(jù)庫需要及時更新[40]。

5.4 近紅外光譜儀的穩(wěn)定性及操作環(huán)境 儀器所產(chǎn)生的噪音是影響測定結(jié)果穩(wěn)定性的主要原因，這種噪音分為長期噪音和短期噪音。長期噪音主要因環(huán)境溫度變化和原件功能衰退而產(chǎn)生，短期噪音主要來源于波長不穩(wěn)定、檢出器和輸入放大器及儀器外部噪音。因此，近紅外的測定一般要求在相當穩(wěn)定的環(huán)境條件下進行[35]。

5.5 定標光譜范圍及方法 根據(jù)每個樣本中不同的光譜范圍，建立不同的定標數(shù)據(jù)庫。如Clark 等[34]報道，測定反芻動物飼料的消化性能宜選擇波數(shù)為1 600～1 900 cm-1和2 200～2 300 cm-1。波數(shù)1 600 ～1 700 cm-1區(qū)域主要與C-H、C-N、N-H 基團有關(guān)，這主要與纖維和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)，而波數(shù)2 200～ 2 300 cm-1區(qū)域主要與C-H 基團相關(guān)，而1 500 cm-1的區(qū)域主要與谷物中O-H 和N-H 基團（水、淀粉和蛋白質(zhì)）相關(guān)。

6 IRS 分析技術(shù)在飼料工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的前景

近十年來，我國IRS 分析技術(shù)無論在研發(fā)還是在應(yīng)用方面都取得了很大進展，并逐步向更深和更廣領(lǐng)域推進，尤其是在飼料、藥品檢測和食品等領(lǐng)域取得了可觀的經(jīng)濟和社會效益[39,41]。Yu 等[42]通過利用FTIS 技術(shù)展示了基于高級同步加速器的生物分析技術(shù)的潛力，用于研究基因修飾、基因沉默和熱加工處理等引起的飼料養(yǎng)分分子結(jié)構(gòu)變化的影響。胡楓竹[43]采用NIR 技術(shù)建立的氨/堿化玉米秸稈快速檢測模型具有較高檢測精度。我國的中、大型飼料企業(yè)也已采用IRS 技術(shù)快速或在線分析手段，對飼料原料進行按質(zhì)論價收購。在保證飼料產(chǎn)品合格的前提下調(diào)整配方，可顯著降低生產(chǎn)成本。隨著便攜式IRS 儀器的研發(fā)和使用[44]，相信IRS 分析技術(shù)在飼料生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用前景將十分廣闊。

7 小 結(jié)

飼料養(yǎng)分的光譜分子結(jié)構(gòu)是評價飼料營養(yǎng)價值的重要信息和依據(jù)，IRS 分析技術(shù)已經(jīng)用于對飼料原料中的常規(guī)成分、氨基酸、有毒有害成分及部分可利用養(yǎng)分的測定，對典型飼料蛋白質(zhì)與CHO 的分子結(jié)構(gòu)特征進行測定，并將測得的數(shù)據(jù)信息與這些飼料的營養(yǎng)價值進行了相關(guān)分析。隨著計算機、數(shù)理統(tǒng)計和化學(xué)計量學(xué)等技術(shù)的快速發(fā)展，IRS 分析技術(shù)作為一種檢測手段預(yù)測飼料的營養(yǎng)價值在飼料生產(chǎn)領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更大的作用。