王利紅，張 偉,2，曹玉嬌

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇姜曲海種豬場，江蘇泰州 225300)

沉默蛋白（Sir2-related Enzymes，Sirtuin）或者沉默信息調(diào)節(jié)因子2（Silence Information Regulator 2，Sir2）最初是在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的組蛋白去乙酰化酶（HDAC）。此后研究發(fā)現(xiàn)，從古細(xì)菌到人類的生命活動，沉默蛋白都發(fā)揮著重要作用。哺乳動物有7 種Sirtuin同源基因SIRT1-SIRT7，它們具有不同的亞細(xì)胞定位和功能[1]。這些蛋白能夠結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、細(xì)胞骨架蛋白等多種因子，通過去乙酰化反應(yīng)或ADP（Adenosine Diphosphate）核糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)參與能量代謝、基因沉默、DNA 損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化等功能過程，是生物學(xué)功能十分廣泛并且作用較為重要的酶類[2]。SIRT5 因具有更大的賴氨酸?；Y(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其除了具有較弱的去乙?；富钚酝?，還有很強(qiáng)的去琥珀酰化、去丙二酰化和去戊二?；富钚?，通過不同的酶活性，參與調(diào)控葡萄糖、氨基酸、脂質(zhì)等多種物質(zhì)代謝過程，并發(fā)揮抗氧化、調(diào)控細(xì)胞和線粒體凋亡和炎性反應(yīng)等生物學(xué)功能[3-5]。截至目前，有關(guān)豬SIRT5 基因在組織中表達(dá)的研究較少，且尚未見在蘇姜豬組織中表達(dá)的研究報(bào)道。本研究以蘇姜豬為研究對象，進(jìn)行SIRT5 基因組織表達(dá)和定位檢測分析，旨在從分子遺傳方面深入了解SIRT5基因在豬組織中的表達(dá)特征，進(jìn)而為優(yōu)質(zhì)豬種的選育提供理論參考。

1 材料方法

1.1 組織樣的采集 選取體重在85 kg 左右的蘇姜豬6頭（公、母各半）。屠宰后立即采集豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、腹脂肪、背最長肌、腿肌、胃、卵巢（母豬）、子宮（母豬）、輸卵管（母豬）等組織，每個(gè)組織3 個(gè)重復(fù)，分裝在 1.5 mL 的Eppendorf 管（EP 管）中，放入液氮進(jìn)行保存和運(yùn)輸。在實(shí)驗(yàn)室中將內(nèi)臟組織存儲在-80℃條件下，用于組織總 RNA 和蛋白質(zhì)的提取。同時(shí)采集各組織樣本置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)檢測。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 提供的豬SIRT5 基因序列使用Primer Premier 5 設(shè)計(jì)引物（表1），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)說明書，使用TRIzol（TaKaRa）提取所有受試豬各組織樣品中的總RNA。取1 000 ng 總RNA，按照SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR 試劑盒說明操作，Real-Time PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：上、下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL，cDNA 1.0 μL，Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL；反應(yīng)條件為95℃，1 min；40 個(gè) 循 環(huán)（95 ℃，15 s，63 ℃，25 s）， 反 轉(zhuǎn)錄成cDNA 于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

1.3 酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 利用ELISA 對蘇姜豬各組織中的蛋白水平進(jìn)行測定：①取適量組織塊，于預(yù)冷的PBS（0.02 mol/L，pH 為7.0～7.2）中清洗去除血液，稱重1.0 g 組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）。②首先將組織塊移入10 mL EP 管中，加入5 mL 預(yù)冷PBS 及10 μL PMSF 蛋白酶抑制劑后，使用電動勻漿機(jī)10 000 r/min 間歇?jiǎng)驖{ 3 min，每次1 min，該過程在冰上進(jìn)行。得到的勻漿液再利用超聲破碎30 s（冰?。?。③將制備好的勻漿液于離心機(jī)中13 000 r/min 離心5 min，取上清用于ELISA 檢測。④蛋白提取液中SIRT5 的蛋白水平使用SIRT5 酶聯(lián)免疫分析ELISA 試劑盒測定，即在酶標(biāo)包被板上的待測樣品孔中先加稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，之后在每孔中加入酶標(biāo)試劑50 μL，封板膜封板后置37℃溫育30 min，加洗滌液靜置30 s 后棄去，重復(fù)洗滌5 次，拍干，每孔加入顯色劑A 和B 各50 μL 混勻，37℃避光顯色10 min，最后每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)后以450 nm 波長測定樣品吸光度。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測 取10%中性福爾馬林溶液中固定的各組織臟器，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，5 μm 厚切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化處理后，用Tris-EDTA（pH=9）作為抗原修復(fù)液，微波加熱至98℃并保持10 min，自然冷卻至室溫后，TBS 洗滌3 次，用3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶。TBS 洗滌3 次后，以5% BSA 于37℃封閉30 min，棄掉封閉液，使用兔抗SIRT5 抗體（CST，1∶250）作為一抗4℃孵育過夜。使用HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（南京生興生物技術(shù)有限公司，sn134，1∶100）作為二抗識別特異性一抗，DAB 顯色液顯色。以蘇木精復(fù)染細(xì)胞核后，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)以心臟組織中表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)，并以2-△△Ct計(jì)算。使用SPSS 19.0 單因素方差分析（ANOVA）及獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，進(jìn)行差異顯著性分析；用雙變量Pearson 相關(guān)分析，P＜0.05 表示差異或相關(guān)顯著。

2 結(jié) 果

2.1 蘇姜豬各組織中SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平通過RT-PCR 及ELISA 方法，在蘇姜豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、腹脂肪、背最長肌、腿肌、胃、卵巢（母豬）、子宮（母豬）、輸卵管（母豬）等組織中均檢測到SIRT5 的表達(dá)（圖1、圖2）。

由圖1 可看出，蘇姜豬公豬SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在心臟和肝臟組織中有豐富的表達(dá)，顯著高于其他組織（P＜0.05）；其次肺臟、大腸、小腸和胃組織的SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平高于脾臟、腎臟、腹脂肪、背最長肌和腿肌組織（P＜0.05）。從各組織中SIRT5 蛋白表達(dá)水平看，胃和大腸組織中表達(dá)量相對最高，均高于脾臟、腎臟、腹脂肪、背最長肌、腿肌組織（P＜0.05），小腸和肺臟組織中表達(dá)量相近，與其他組織中表達(dá)量差異不顯著，腹部脂肪中表達(dá)量相對最低，低于心臟、大腸和胃組織（P＜0.05）。

由圖2 可看出，蘇姜豬母豬的小腸組織中SIRT5 mRNA 表達(dá)量相對最高，顯著高于其他組織（P＜0.05）；其次在心臟、肺臟、腎臟、大腸、胃、卵巢、輸卵管組織中也有較豐富的表達(dá)量，但與其他剩余組織間差異不顯著。從各組織中SIRT5 蛋白表達(dá)結(jié)果看，心臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、子宮和輸卵管組織中的表達(dá)量高于肝臟、脾臟、腹脂肪、背最長肌、腿肌、胃和卵巢組織（P＜0.05）。

由表2 可看出，蘇姜豬公豬各組織SIRT5 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平間未達(dá)到線性顯著相關(guān)（P＞0.05），而母豬各組織SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平間則呈線性極顯著相關(guān)性（P＜0.01）。

圖1 SIRT5 在蘇姜豬公豬不同組織臟器中的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平

圖2 SIRT5 在蘇姜豬母豬不同組織臟器中的mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平

表2 蘇姜豬SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

2.2 SIRT5 在蘇姜豬組織中的表達(dá)定位分布 通過免疫組織化學(xué)方法，在蘇姜豬的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、大腸、小腸、脂肪、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮等組織中均檢測到SIRT5 免疫陽性細(xì)胞，且免疫陽性顆粒主要定位于各組織構(gòu)成細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖3）。由圖3 可看出，SIRT5 蛋白免疫陽性顆粒在蘇姜豬多種臟器的組織細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，且在肌肉細(xì)胞（如心臟的心肌細(xì)胞、背最長肌和腿肌的肌細(xì)胞、胃和腸的肌層細(xì)胞、子宮和輸卵管的肌層細(xì)胞）有豐富的表達(dá)。此外，在肝臟的肝細(xì)胞、脾臟的紅髓細(xì)胞、肺臟的肺泡壁上皮層和支氣管黏膜層的細(xì)胞、腎臟皮質(zhì)迷路的近曲小管內(nèi)皮細(xì)胞、大腸和小腸腸腺和固有層細(xì)胞、脂肪組織的脂肪細(xì)胞、胃組織的固有腺層細(xì)胞、卵巢卵泡顆粒細(xì)胞以及子宮和輸卵管組織的黏膜層細(xì)胞中也有豐富的免疫陽性顆粒。

圖3 SIRT5 在蘇姜豬多種組織內(nèi)的免疫組化檢測

3 討 論

SIRT5 作為Sirtuins 家族中的一員，具有去乙?；?、去琥珀?；?、去丙二?；讣叭ノ於；富钚?，主要參與調(diào)控葡萄糖、脂質(zhì)、活性氧（ROS）、ATP 等物質(zhì)和能量代謝過程[6]。在動物組織中SIRT5表達(dá)具有廣泛性，且在動物的心臟、肝臟、肌肉、腦以及生殖器官組織中呈高表達(dá)[3]。本研究通過RT-PCR、ELISA 和免疫組織化學(xué)方法在蘇姜豬公豬11 個(gè)組織和母豬14 個(gè)組織中均檢測到SIRT5 mRNA 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，表明蘇姜豬組織中SIRT5 表達(dá)同樣具有廣泛性；通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，蘇姜豬母豬組織中SIRT5 mRNA相對表達(dá)量與蛋白表達(dá)量間呈線性極顯著相關(guān)，表明該基因在蘇姜豬母豬組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平具有一致性，但公豬mRNA 相對表達(dá)量與蛋白表達(dá)量間則未呈顯著線性相關(guān)，表明公、母蘇姜豬不同組織細(xì)胞中SIRT5 調(diào)控機(jī)制存在差異。

本研究結(jié)果顯示，蘇姜豬公豬SIRT5 mRNA 在心臟和肝臟組織中表達(dá)量相對最高，顯著高于其他組織，脾臟中表達(dá)量相對最低。這一結(jié)果與Jin 等[7]報(bào)道的通城豬公豬的SIRT5 mRNA 組織表達(dá)譜結(jié)果相似。然而，本實(shí)驗(yàn)中SIRT5 mRNA 在胃組織中的相對表達(dá)量則與通城豬公豬的結(jié)果不同，從ELISA 檢測結(jié)果看，蘇姜豬公豬胃組織中SIRT5 蛋白表達(dá)量也較高。對比蘇姜豬公豬SIRT5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，脾臟和腹脂肪組織中表達(dá)量相對均最低，其次是背最長肌、腿肌和腎臟組織，而表達(dá)量差異相對較大的為心臟、胃、肝臟、肺臟、大腸和小腸組織。

在動物機(jī)體物質(zhì)和能量代謝過程中SIRT5 發(fā)揮著重要的作用，SIRT5 缺失會導(dǎo)致動物機(jī)體幾種代謝途徑紊亂，且已有研究表明，SIRT5 可以作為秦川牛肉品質(zhì)性狀的候選基因，用于加速優(yōu)質(zhì)肉牛品種的選育[3-5,8-9]。本研究中，公、母蘇姜豬脾臟、腹部脂肪、背最長肌和腿肌組織中SIRT5mRNA 表達(dá)量均相對較低，心臟、胃、肺臟和肝臟組織中有一定豐度的表達(dá)量，而在腎臟、大腸和小腸組織中表達(dá)量則母豬相對較高、公豬相對較低；母豬組織中的SIRT5 蛋白表達(dá)量總體相對低于公豬，這一點(diǎn)與母豬的生長勢較公豬弱（如蘇姜豬成年公豬平均體重204.68 kg，母豬體重168.71 kg）的特點(diǎn)相符。除生長勢外，公、母豬在屠宰與肉品質(zhì)方面也存在差異，如閹公豬的腹脂重顯著低于母豬，而閹公豬肉的飽和脂肪酸含量顯著高于母豬，且其肉色、貯存損失、熟肉率上均有一定優(yōu)勢，母豬則在大理石紋評分和失水率上稍有優(yōu)勢[10-11]。這種生長或肉品質(zhì)性狀差異是否與SIRT5基因表達(dá)有關(guān)，尚待后續(xù)進(jìn)一步研究。

通過免疫組織化學(xué)方法，在所測定的蘇姜豬組織中均檢測到SIRT5 免疫陽性顆粒。肝臟是動物機(jī)體內(nèi)重要的代謝器官。Nakagawa 等[12]研究表明，SIRT5 缺失的小鼠在長期饑餓后磷酸合成酶1（CPS1）的乙酰化程度升高，氨濃度增加，顯示SIRT5 與肝臟中氨的代謝相關(guān)。本研究在蘇姜豬肝細(xì)胞中檢測到了豐富的SIRT5免疫陽性顆粒。在消化系統(tǒng)中，SIRT5 免疫陽性顆粒主要定位于蘇姜豬胃組織的胃底腺層細(xì)胞和大腸、小腸的腸腺細(xì)胞，表明SIRT5 與腺細(xì)胞的分泌功能有關(guān)。機(jī)體最大的免疫器官——脾臟含有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心。通過細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，SIRT5 免疫陽性顆粒主要分布于蘇姜豬脾臟的紅髓細(xì)胞。肌肉是動物機(jī)體能量代謝的主要組織。本研究在蘇姜豬心臟、背最長肌和腿肌的肌細(xì)胞中均檢測到SIRT5 免疫陽性顆粒，表明SIRT5 在蘇姜豬能量代謝過程中具有重要作用。

氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）是SIRT5 的一個(gè)重要底物，是尿素循環(huán)過程中重要的限速酶。SIRT5 不僅可以直接去乙酰化作用CPS1，增強(qiáng)其活性，而且在能量限制條件下還可以間接提高CPS1 的活性，限制尿素循環(huán)起始步驟，完成氨的解毒，在禁食或高蛋白質(zhì)飲食期間，SIRT5 基因敲除小鼠的血液中有較高水平的氨，正是因CPS1 去乙酰程度降低，其活性降低所至[8,12]。當(dāng)SIRT5 過表達(dá)時(shí)，CPS1 的戊二?；浇档?，其酶活性升高[12-13]。通過細(xì)胞定位檢測，SIRT5 免疫陽性顆粒主要在蘇姜豬腎臟的皮質(zhì)迷路近曲小管的內(nèi)皮細(xì)胞中分布。在生殖系統(tǒng)中，SIRT5 免疫陽性顆粒主要分布于蘇姜豬輸卵管和子宮的黏膜層細(xì)胞中，表明SIRT5 與生殖道分泌功能有關(guān)，但其表達(dá)量相對不高。在卵巢組織中，SIRT5 免疫陽性顆粒主要分布于卵泡的顆粒層細(xì)胞，表明SIRT5 與顆粒細(xì)胞的功能有關(guān)，進(jìn)而間接決定著卵母細(xì)胞的生長成熟；在卵巢黃體中未檢測到SIRT5免疫陽性顆粒，表明該基因不參與黃體功能的行使。

4 結(jié) 論

SIRT5 在蘇姜豬組織中具有表達(dá)廣泛性，但僅母豬組織中SIRT5 轉(zhuǎn)錄與翻譯水平呈極顯著線性相關(guān)；在組織臟器中，在物質(zhì)和能量代謝旺盛的組織（如胃、腸、肝臟、肌肉和腎臟等）中有相對較高的表達(dá)量，但母豬SIRT5 蛋白表達(dá)量總體低于公豬；SIRT5 免疫陽性顆粒主要定位于肝細(xì)胞、脾臟的紅髓細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、近曲小管內(nèi)皮細(xì)胞、胃和腸組織腺細(xì)胞、卵泡顆粒細(xì)胞、黏膜層細(xì)胞以及多種臟器的肌細(xì)胞中。