類烏齊牦牛SIRT3基因克隆與生物信息學及差異表達分析

楊玉梅，柴志欣，王 會，王吉坤，信金偉，姬秋梅，鐘金城*

（1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部重點實驗室，四川成都 610041；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點實驗室，西藏拉薩 850009）

哺乳動物的沉默信號調(diào)節(jié)因子（The Silent Information Regulator，Sirtuin）家族是酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2（SIR2）的同源蛋白質(zhì)，是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD+）依賴的去乙酰化酶，廣泛存在于原核生物和真核生物，具有7 個家族成員SIRT1-7[1-2]。沉默信號調(diào)節(jié)因 子3（Silent Mating Type Information Regulation 3，SIRT3）主要定位于線粒體，調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的細胞活力及能量代謝[3]。對缺失SIRT3 的小鼠進行饑餓試驗，48 h 后發(fā)現(xiàn)肝臟和血漿中的脂肪堆積異常且棕櫚酸的氧化速率降低，脂肪酸β- 氧化發(fā)生障礙[4]；在棕色脂肪細胞分化過程中會存在SIRT3 的誘導表達[5]，白藜蘆醇能上調(diào)肝細胞SIRT3 的表達與活性，改善肝細胞線粒體功能，減輕肝細胞氧化應激損傷[6]。以上研究表明，SIRT3 對調(diào)節(jié)肝細胞氧化代謝及脂肪代謝發(fā)揮重要作用。

牦牛是青藏高原畜牧業(yè)發(fā)展的主要畜種，為當?shù)啬撩裉峁┵囈陨娴纳a(chǎn)和生活資料。類烏齊因其氣候宜人，植被豐富，俗稱“西藏小瑞士”。類烏齊牦牛遺傳多樣性豐富，保持了“原生態(tài)、純天然、全綠色”等特點，肉質(zhì)鮮美，致密有彈性，富含蛋白質(zhì)和氨基酸，口味濃郁，營養(yǎng)價值高，保持了“原生態(tài)、純天然、全綠色”等特點，2018 年正式公布成為國家優(yōu)良牦牛遺傳資源。本實驗通過對類烏齊牦牛SIRT3 基因的克隆與生物信息學等研究，為進一步探討影響類烏齊牦牛肝臟組織中脂肪代謝的主要影響因素提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 樣品采集于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣，選取3 頭4.5 歲健康雌性類烏齊牦牛，分別采集肝臟、心臟、臀大肌組織，立即用滅菌DEPC 水沖洗，置于液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 引物設計 參考GenBank 普通牛SIRT3 基因序列（NM_001206669.1），使用Primer premier5.0 設計引物（表1），由英濰捷基（上海）生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 選取類烏齊牦牛肝臟組織用于克隆，用Trizol 法提取肝臟組織的總RNA，用分光光度計檢測RNA 濃度，電泳檢測RNA 完整性并分裝保存于-80℃。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）說明書步驟將總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.3 SIRT3 基因PCR 擴增 以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR 擴增體系（25 μL）：cDNA（20 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 pmol/mL）各1 μL，無菌去離子水 9.5 μL，Taq Green PCR Master Mix 12.5 μL。PCR 反應程序：95℃ 4 min 預變性；94℃ 40 s，64℃ 45 s，72℃ 70 s，共34 個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.4 QPCR 分析 反應體系10 μL： SYBR premix Dimer Eraser（2x）5 μL，上、下引物（10 pmol/mL）各0.4 μL，無菌去離子水3.2 μL，cDNA（20 ng/μL）1 μL。定量程序：95℃預變性30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。分別取3 頭牦牛的心臟、肝臟、臀大肌組織進行定量分析，每個組織3 個重復。反應結(jié)束后以熔解曲線來判定QPCR 反應的特異性，獲得每個樣品的CT 值，采用2-ΔΔCT法，GAPDH 作為內(nèi)參基因?qū)颖径拷Y(jié)果進行處理，計算各個樣本的相對表達水平，每組重復取平均值。利用SPSS 16.0 軟件對SIRT3 基因在不同組織器官的表達水平進行單因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

1.3 目的基因克隆 純化回收后的PCR 產(chǎn)物與PMD19-T載體16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，送擎科生物科技有限公司測序。

1.4 生物信息學分析 將所得序列進行BLAST 比對分析，利用Clustalx 和Mega5.0 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，DNASTAR 進行同源性分析。利用在線軟件ExPASy、SWISSMODEL 相關程序分析SIRT3 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征。利用SignaIP 4.1、TMpred、PSORT Ⅱ軟件預測SIRT3 基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛SIRT3 基因的RT-PCR 擴增 根據(jù)PCR 擴增結(jié)果，目的條帶與預期大小一致（圖1）。類烏齊牦牛SIRT3 基因CDS 區(qū)長1 002 bp，共編碼333 個氨基酸。牦牛與普通牛（NM_001206669.1）SIRT3 基因CDS 區(qū)對比發(fā)現(xiàn)，存在6 個突變位點（49、279、342、384、149、620 bp），分別導致密碼子TTG→CTG（亮氨酸）、CCA→CCG（ 脯 氨 酸）、GAA→GAG（ 谷 氨酸）、TTC→TTT（亮氨酸），以上均為同義突變；GGC→GAC（甘氨酸變成天冬氨酸）、GTG→GCG（纈氨酸變成丙氨酸）為錯義突變（圖2）。

圖1 牦牛SIRT3 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物電泳圖

表1 類烏齊牦牛SIRT3 基因的引物序列

2.2 SIRT3 蛋白理化性質(zhì)分析 使用ProtParam 預測，SIRT3 基因編碼蛋白含負電荷殘基總數(shù)（天冬氨酸+谷氨酸）33 個，正電荷殘基總數(shù)（精氨酸+ 賴氨酸）39 個，正負殘基含量相差較小。SIRT3 蛋白分子質(zhì)量為36 961.69 u，等電點（PI）為9.00，其不穩(wěn)定指數(shù)為36.34，屬穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為91.95，親水系數(shù)（GRAVY）為-0.036，表現(xiàn)為親水性。疏水性分析顯示，多肽鏈第77 位纈氨酸分值最高（2.689），第196 位酪氨酸分值最低（-2.044），整個肽鏈在尾部呈親水性，為可溶性蛋白。

2.3 SIRT3 蛋白功能預測

2.3.1 跨膜結(jié)構(gòu)域預測 利用TMpred 和SignalP 4.1 預測SIRT3 蛋白跨膜區(qū)域，存在多個跨膜區(qū)域，最優(yōu)跨膜拓撲結(jié)構(gòu)僅一處位于其內(nèi)部N 端（29～49 aa），同時TM- 螺旋長度預測在17～33 aa。不含信號肽，屬非分泌性蛋白。

圖3 類烏齊牦牛SIRT3 蛋白磷酸化位點預測

2.3.2 磷酸化位點預測 使用NetPhos 3.1 Server 預測SIRT3 基因編碼序列的磷酸化位點，共發(fā)現(xiàn)23 個磷酸化位點，包含14 個絲氨酸磷酸化位點和9 個蘇氨酸磷酸化位點（圖3）。亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，牦牛成熟SIRT3蛋白主要存在于線粒體（69.6%），部分存在于細胞質(zhì)（17.4%）、細胞核（8.7%）及細胞骨架（4.3%）。

圖2 類烏齊牦牛SIRT3 基因與普通牛CDS 區(qū)比對

圖4 類烏齊牦牛SIRT3 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

圖5 類烏齊牦牛與其他物種SIRT3 氨基酸比對

圖6 類烏齊牦牛SIRT3 預測二級結(jié)構(gòu)

2.3.3 保守結(jié)構(gòu)域預測 使用NCBI 預測SIRT3 蛋白的保守區(qū)域。由圖4 可知，該蛋白屬SIR2 蛋白超家族結(jié)構(gòu)域，包括Sir2 酶，其催化NAD+依賴性蛋白質(zhì)/組蛋白脫乙?；?，其中來自賴氨酸ε-氨基的乙?；D(zhuǎn)移至NAD +的ADP-核糖部分，產(chǎn)生煙酰胺和代謝產(chǎn)物O-乙酰基-ADP-核糖。SIRT1 結(jié)構(gòu)域，包括人SIRT1-3和酵母Hst1-4，屬于SIR2 蛋白家族成員，Sir2 酶催化NAD+ 依賴性蛋白質(zhì)/ 組蛋白脫乙?；?。同時，包含14 個NAD + 結(jié) 合 位 點（80、82、83、90、91、143、161、162、164、181、252、257、278、279、298），11 個底物結(jié)合位點（163、181、225、227、228、229、230、231、256、257、258）和4 個Zn 結(jié)合位點（189、192、213、216）。

2.3.4 功能結(jié)構(gòu)域預測 使用Clustal W 2.1 Version 分析發(fā)現(xiàn)，類烏齊牦牛SIRT3 蛋白包含保守KIV 與GIP 功能區(qū)域（圖5），是基因沉默必不可少的核心區(qū)域。利用Psipred 的FFpred 預測蛋白質(zhì)功能，該蛋白在含磷酸化合物代謝、線粒體組織、小分子代謝及調(diào)節(jié)代謝等一系列生物合成過程中發(fā)揮調(diào)控作用，其中在催化活性、核苷酸結(jié)合及輔因子結(jié)合等過程中發(fā)揮主要作用（表2）。

2.3.5 高級結(jié)構(gòu)預測 使用SOPMA 預測類烏齊牦牛SIRT3 蛋白二級結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋和無規(guī)卷曲為二級結(jié)構(gòu)主要組成部分，分別占35.44%和44.44%，延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角分別占13.81%和6.31%（圖6），牦牛SIRT3 基因編碼蛋白為混合類蛋白質(zhì)。使用SWISSMODEL 預測其三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，含少量β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。該結(jié)果與SOPMA軟件預測類烏齊SIRT3 蛋白二級結(jié)構(gòu)一致（圖7）。

2.5 同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 利用ClustalX 和MAGA5.2 構(gòu)建類烏齊牦牛與普通牛（Bos taurus）、山羊（Capra hircus）、野豬（Sus scrofa）、家貓（Felis catus）、人（Homo sapiens）、家兔（Oryctolagus cuniculus）、小鼠（Mus musculus）、大鼠（Rattus norvegicus）和斑馬魚（Danio rerio）SIRT3 基因核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明，類烏齊牦牛與普通牛親緣關系最近，與斑馬魚親緣關系最遠（圖8）。用DNASTAR 的MegAlign 對類烏齊牦牛進行一致性分析，發(fā)現(xiàn)類烏齊牦牛與普通牛、山羊、野豬、家貓、人、家兔、小鼠、大鼠、斑馬魚的一致性分別為99.4%、96.8%、89.7%、78.4%、82.1%、79.5%、81.5%、82.7%、59.9%，其分析結(jié)果與物種間親緣關系理論一致（圖9）。

2.6 QPCR 分析 由圖10 可知，SIRT3 基因在類烏齊牦牛肝臟組織中的表達水平顯著高于其他組織（P＜0.01），心臟組織與臀大肌組織中的表達水平差異不顯著。

表2 SIRT3 基因功能分析結(jié)果

3 討 論

3.1 類烏齊牦牛SIRT3 基因分子特性分析 線粒體是細胞內(nèi)進行脂肪酸氧化代謝的核心細胞器，線粒體中脂肪酸氧化是脂肪消耗的主要方式，相關研究顯示，3T3L1細胞分化后用抗霉素處理，抑制線粒體的氧化呼吸可顯著促進細胞內(nèi)脂質(zhì)的積累，說明線粒體的功能與脂肪沉積存在重要關系[7]。脂肪細胞分化需大量ATP，成脂分化前期，線粒體進行氧化磷酸化可產(chǎn)生脂肪細胞分化過程中所需的大量ATP。研究發(fā)現(xiàn)，許多線粒體蛋白賴氨酸的乙?；癄顟B(tài)均是由SIRT3 基因調(diào)節(jié)[8-9]，線粒體蛋白賴氨酸乙?；钦{(diào)節(jié)脂肪代謝的重要途徑，而其乙?；皆诤艽蟪潭壬先Q于NAD+依賴性去乙酰化酶[10]。對于已經(jīng)成脂分化的3T3L1 細胞，通過基因轉(zhuǎn)染過表達SIRT3 可顯著減少細胞內(nèi)線粒體數(shù)量，而抑制SIRT3的表達則會增加細胞內(nèi)線粒體數(shù)量[11]。

圖7 類烏齊牦牛SIRT3 蛋白三級結(jié)構(gòu)的預測

圖8 用鄰接（NJ）法對類烏齊牦牛與其他品種間SIRT3 基因序列構(gòu)建的進化樹

圖9 類烏齊牦牛SIRT3 同源性分析

圖10 牦牛SIRT3 基因的mRNA 組織表達分析

Sirtuin 家族的催化核心由NAD+ 結(jié)合域和小亞結(jié)構(gòu)域組成，NAD+ 結(jié)合域由Rossman 折疊構(gòu)成，是許多NAD+ 和NADP 結(jié)合酶的特征域；小亞結(jié)構(gòu)域包括一個螺旋構(gòu)件和一個鋅結(jié)合[12]。大小結(jié)構(gòu)域之間形成了一個裂隙，為NAD+ 提供了結(jié)合位點，乙?；脑谶@個裂縫里結(jié)合形成酶- 底物的β- 折疊結(jié)構(gòu)而發(fā)生催化反應[13]。本研究中類烏齊牦牛SIRT3 蛋白包含SIR2蛋白超家族結(jié)構(gòu)域和SIRT1 結(jié)構(gòu)域，這與Sirtuin 家族基本結(jié)構(gòu)吻合。類烏齊牦牛SIRT3 基因氨基酸序列發(fā)現(xiàn)2 個特異性保守結(jié)構(gòu)域KIV 和GIP，是SIRT3 蛋白調(diào)控基因沉默的關鍵功能結(jié)構(gòu)域[14]，與人SIRT3 蛋白具有相似的功能，說明不同物種SIRT3 蛋白結(jié)構(gòu)的相似性較大。亞細胞定位和功能分析顯示，類烏齊牦牛SIRT3蛋白位于線粒體，該蛋白在含磷酸化合物代謝、線粒體組織及調(diào)節(jié)代謝等生物合成過程發(fā)揮作用，但在催化活性、核苷酸結(jié)合及輔因子結(jié)合等過程發(fā)揮主要作用。就目前研究而言，紅鰭東方鲀SIRT3 蛋白功能對中央中介代謝、翻譯、脂肪酸代謝和輔因子生物合成等過程發(fā)揮調(diào)控作用[10]，與本研究在脂肪代謝和輔因子結(jié)合等過程發(fā)揮調(diào)控作用相同，說明該基因具有保守性，但魚類與家畜在遺傳機制、遺傳基礎、身體構(gòu)造及所處環(huán)境有較大差異，該蛋白調(diào)控過程存在差異也屬正常。

3.2 SIRT3 蛋白所含氨基酸分析 目前，對SIRT3 基因的研究主要集中在人、小鼠、豬和牛等，對牦牛SIRT3 基因的研究鮮有報道。本實驗發(fā)現(xiàn)，類烏齊牦牛SIRT3 基因CDS 區(qū)長1 002 bp，編碼333 個氨基酸，這與牛SIRT3基因CDS 區(qū)長1 002 bp，共編碼333 個氨基酸的結(jié)果相同[15]，與紅鰭東方鲀SIRT3 基因CDS 區(qū)長1 263 bp、編碼420 個氨基酸的結(jié)果差異較小[16]，說明SIRT3 基因在進化過程中相對保守。

與普通牛比對，類烏齊牦牛SIRT3 基因CDS 區(qū)存在甘氨酸突變成天冬氨酸、纈氨酸突變?yōu)楸彼? 處錯義突變。天冬氨酸是生物體內(nèi)多種氨基酸及嘌呤、嘧啶堿基的合成前體，作為生物體內(nèi)氨基提供者參與許多代謝途徑[17]，這也成為SIRT3 基因在不同組織線粒體中發(fā)揮作用的物質(zhì)保障。SIRT3 可去乙酰化激活乙酰-Co A 合成酶（Ace CS2），Ace CS2 是一個線粒體酶，可以利用乙酸鹽、Co A 和ATP 生成乙酰-Co A，乙酰-Co A 是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，也是膽固醇和脂肪酸合成的主要底物[18]。天冬氨酸可介導還原當量通過線粒體膜的轉(zhuǎn)移，進而調(diào)控細胞的糖酵解和氧化還原狀態(tài)，還可通過合成天冬酰胺調(diào)節(jié)免疫功能[19-20]，是類烏齊牦牛的能量代謝及提高免疫的重要物質(zhì)基礎，還可作為K+、Mg2+

的載體向心肌輸送電解質(zhì)，從而改善心肌收縮功能，同時降低氧消耗，在冠狀動脈循環(huán)障礙缺氧時，對心肌有保護作用。牦牛生活在高原缺氧環(huán)境，天冬氨酸可保護牦牛的心肌有利于其在極端環(huán)境生存。而丙氨酸可協(xié)助葡萄糖代謝，補充類烏齊牦牛在溫差較大的高原環(huán)境所需能量。在氨基酸對豬小腸上皮細胞抗菌肽和信號通路蛋白表達影響的研究中發(fā)現(xiàn)，用丙氨酸處理可顯著提高Sirt1 的表達水平[21]，飼糧中添加適量β-丙氨酸能改善肉仔雞肉品質(zhì)[22]，SIRT3 基因部分位點突變可能是其肉質(zhì)鮮美的影響因素。而秦川牛SIRT3 基因發(fā)現(xiàn)第5外顯子22522 C＞T 突變，與其部分體尺、肉品質(zhì)性狀極顯著相關[23]，與本研究結(jié)果突變位點一致，可進一步進行該基因突變位點與牦牛體尺及肉品質(zhì)性狀的相關性分析。

3.3 類烏齊牦牛SIRT3 基因表達分析 SIRT3 基因在臀大肌中表達水平最低，在肝臟組織中的表達水平最高。肝臟作為機體主要代謝器官，肝臟中SIRT3 不僅參與脂肪酸的合成和分解代謝，也參與調(diào)控饑餓條件下酮體生成；肝臟中SIRT3 還可調(diào)控尿素循環(huán)，促進細胞內(nèi)氨基酸代謝生成氨的解毒作用。SIRT3 在肝臟中主要參與物質(zhì)的氧化分解，為細胞生理活動提供ATP，抑制富余營養(yǎng)物質(zhì)如脂肪酸等在肝臟中的積累。結(jié)果顯示，與物質(zhì)和能量代謝密切相關的SIRT3 在肝臟、心臟及肌肉等代謝旺盛的組織中表達量相對較高[24]，這與在豬SIRT3 肝臟組織中表達水平最高的結(jié)果相似[10]。同時在禁食期間，與野生型小鼠相比，敲除SIRT3 小鼠的脂肪酸代謝中間產(chǎn)物的濃度發(fā)生異常，肝臟中甘油三酯也明顯增多，但其在肝臟中的脂肪酸吸收以及分解作用正常[25]，這也從側(cè)面說明SIRT3 基因在維持肝臟中脂肪正常代謝發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論本研究顯示，類烏齊牦牛SIRT3 基因編碼區(qū)在生物進化中具有較高保守性，SIRT3 基因在肝臟、心臟、臀大肌均表達，且在肝臟中的表達量最高，為進一步闡明SIRT3 基因在肝臟組織中脂肪代謝奠定基礎。