響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取檳榔多糖工藝及其抗炎活性

唐敏敏 陳華 李瑞

摘? 要：采用響應(yīng)面組合設(shè)計優(yōu)化超聲波提取未成熟的檳榔籽多糖的工藝。結(jié)果表明，提取功率、提取液料比和提取時間均能顯著影響檳榔多糖的得率，且在預(yù)測的最佳工藝參數(shù)（提取功率630 W，提取液料比20.76 mL/g，提取時間501s）條件下，檳榔多糖的實際提取率為（3.3206±0.0099）%。另外，檳榔多糖可以抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細胞（RAW 264.7）內(nèi)一氧化氮的生成，其IC50為85.64 μg/mL，說明檳榔多糖具有一定的抗炎潛力。

關(guān)鍵詞：檳榔多糖;超聲波提取;抗炎

中圖分類號 R284.1? ?文獻標識碼 A? ?文章編號 1007-7731（2019）09-0021-5

Abstract：This study determined the optimal conditions for ultrasound-assisted extraction of a polysaccharide，Areca nut polysaccharide，from the seed of Areca nut using response surface methodology.The optimal extraction ultrasonic power，ratio of liquid to raw material，and extraction time were 630W，20.76 mL/g and 503s，respectively，giving a yield of （3.3206±0.0099）%.The result showed that Areca nut polysaccharide inhibited NO production in lipopolysaccharide （LPS） treated RAW 264.7 cells with a dose-dependent manner.The IC50 value was 85.64 μg/mL，which indicated that areca nut polysaccharide had anti-inflammatory potential.

Key words：Areca nut polysaccharide;Ultrasound-assisted extraction;Anti-inflammatory activity

檳榔是棕櫚科植物檳榔（Arecacatechu L.）的果實，可食用、亦可藥用。檳榔作為海南省第一大熱作經(jīng)濟作物[1]，其產(chǎn)量占全國總產(chǎn)量的95%以上，且絕大部分用作食用檳榔產(chǎn)業(yè)的原料。然而，2003年8月7日國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer，IARC）在其特別刊物第85卷中認定檳榔為一級致癌物，指出常嚼檳榔會造成口腔黏膜下纖維化，這是導(dǎo)致口腔癌病變的主要原因。從此，海南檳榔種植產(chǎn)業(yè)經(jīng)常被“致癌”風(fēng)波嚴重影響經(jīng)濟效益。

檳榔為我國“四大南藥”之首，在我國中醫(yī)藥中的應(yīng)用已超過1000年。據(jù)不完全統(tǒng)計，國內(nèi)外共有225個藥品采用檳榔作為原料，其中，2015年版《中華人民共和國藥典》錄入了檳榔、焦檳榔、大腹殼等3味檳榔藥材，外加木香檳榔丸、檳榔四消丸（大蜜丸和水丸）等3味以檳榔為主要原料的成方制劑[2]?，F(xiàn)代研究表明，檳榔含有多種活性成分，如檳榔油、生物堿、多酚、鞣質(zhì)等物質(zhì)，具有抗氧化、緩解疲勞[3]、改善腸胃功能[4]、治療糖尿病[5，6]、促進神經(jīng)興奮[7]、預(yù)防癌癥[8]、保護血管[9]、抑制破骨基因表達[10]等多種生理活性。因此，檳榔具有較高的保健和藥用價值。但目前，我國檳榔加工技術(shù)水平仍處于初級加工階段，缺乏高附加值產(chǎn)品，嚴重影響了檳榔產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

多糖是廣泛存在于動物、植物、微生物中的一類碳水化合物，因其具有獨特的物理化學(xué)特性和生物活性，越來越受到人們的關(guān)注和重視。迄今為止，大量研究結(jié)果表明，多糖具有廣泛的藥理活性[11]。

目前，有關(guān)檳榔活性成分的研究主要集中于生物堿、多酚、色素等方面，而多糖方面則鮮見報道。本課題組前期研究結(jié)果表明，檳榔多糖粗提物（ASP）具有良好的體外的抗氧化活性，并可以抑制人皮膚成纖維細胞（HSF）內(nèi)氧化損傷[12]。本研究擬通過響應(yīng)面法確定了檳榔多糖的最佳提取工藝，了解其對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細胞（RAW 264.7）產(chǎn)生一氧化氮（NO）的抑制作用，以期為檳榔的精深加工和海南檳榔產(chǎn)業(yè)綠色轉(zhuǎn)型繼續(xù)提供理論支撐。

1 材料

1.1 原料 5月齡左右的檳榔鮮果，采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所科研基地。清洗后晾干，取種子冷凍干燥，粉碎備用。

1.2 細胞系 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（RAW 264.7）細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.3 培養(yǎng)基 高糖DMEM培養(yǎng)基：含4500mg/L D-葡萄糖、584mg/L L-谷氨酰胺、3700mg/L碳酸氫鈉、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素，pH值7.0～7.4。

2 實驗方法

2.1 檳榔多糖的超聲波提取 工藝流程如下：新鮮檳榔→去殼→冷凍干燥→粉碎→石油醚浸泡→過濾，揮干有機溶劑→蒸餾水浸泡→冰浴超聲波提取→離心→乙醇沉淀→水復(fù)溶→冷凍干燥→檳榔粗多糖。分別稱取2.00g檳榔籽粉末，以水作為溶劑，按照不同的提取超聲功率、不同提取時間以及不同液料比進行冰浴-超聲波提取，將提取液離心，其殘渣按照同樣的超聲提取條件重復(fù)提取1次，合并提取液。將提取液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，向濃縮后的多糖溶液中加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜，離心得到析出的多糖，然后將沉淀加水復(fù)溶得到多糖提取物的水溶液。向提取物水溶液中加入1/5體積的sevage試劑，混合震蕩，除去有機層，重復(fù)3～4次，直至水相和有機相之間沒有白色乳狀層為止。待水相冷凍干燥，即得檳榔粗多糖，稱重后，溶解到一定體積的蒸餾水中，備用。

2.2 苯酚-硫酸法檢測多糖含量 精確移取系列濃度標準無水葡萄糖溶液（0、8、16、24、32、40、48μg/mL）各2mL，分別加入6%苯酚溶液1.00mL，搖勻后迅速加入5.00mL濃硫酸，混勻，1～2min后于沸水液中加熱 15min，取出放入冰水浴冷卻15min，于485nm下測定吸光度。以吸光度為縱坐標，對應(yīng)葡萄糖溶液濃度為橫坐標進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.3 檳榔多糖樣品含量及得率的計算 取一定的檳榔多糖溶液，按照2.2中的操作方法于485nm出測定其吸光值，代入回歸方程及以下公式，即可算出檳榔中多糖的提取率。

多糖得率（%）=C×N×V/106/W×100

式中：C為多糖溶液的濃度（μg/mL）;V為多糖溶液體積（mL）;N為測定時多糖溶液的稀釋倍數(shù);W為檳榔粉末質(zhì)量（g）。

2.4 超聲波輔助提取法提取檳榔多糖單因素實驗

2.4.1 超聲波功率 準確稱取干燥的檳榔粉末2.00g于100mL燒杯中，分別加入40mL蒸餾水后，依次采用270W、360W、450W、540W、630W提取多糖，提取360s。得到粗多糖溶液，去除蛋白，冷凍干燥，復(fù)溶，測定多糖含量，計算得率。

2.4.2 液料比 準確稱取干燥的檳榔粉末2.00g于10mL燒杯中，分別加入20mL、30mL、40mL、50mL、60mL的蒸餾水后，采用540W的提取功率，提取多糖360s，得到粗多糖溶液，去除蛋白，冷凍干燥，復(fù)溶，測定多糖含量，計算得率。

2.4.3 提取時間 準確稱取干燥的檳榔粉末2.00g于100mL燒杯中，分別加入40mL蒸餾水后，采用540W的提取功率，依次提取多糖120、240、360、480、600s。得到粗多糖溶液，去除蛋白，冷凍干燥，復(fù)溶，測定多糖含量，計算得率

2.4.4 響應(yīng)面設(shè)計 以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，每個因素選擇3個影響較大的水平，以檳榔多糖提取量為響應(yīng)值，建立3因素3水平中心組合試驗，各因素3個水平采用-1，0，1進行編碼。超聲波破碎法提取檳榔多糖因素與水平設(shè)計見表1。

2.5 檳榔多糖的抗炎作用研究

2.5.1 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。換液后待細胞生長融合度達到70%～80%即可進行傳代。根據(jù)不同實驗要求，將單細胞懸液稀釋至需要的濃度接種至孔板中，或分裝到培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

2.5.2 RAW264.7細胞存活率 將100μL密度為5×104個/mL的細胞接種于96孔板中，37℃，5%二氧化碳濃度，培養(yǎng)過夜，加入不同濃度的檳榔多糖，每個濃度至少3個平行。放回細胞培養(yǎng)箱中孵育24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育2h后，取出96孔板。吸出上清，每孔加入200μLDMSO，待甲臜結(jié)晶充分溶解后，用酶標儀于495nm波長測量吸光度。計算公式如下：

存活率（%）=加藥孔OD值/對照孔OD值×100

2.5.3 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞產(chǎn)生的一氧化氮含量 將100μL密度為5×105個/mL的細胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)，實驗組加入LPS（終濃度為1μg/mL）培養(yǎng)1h后，繼續(xù)加入不同濃度的檳榔多糖溶液，正常組不做任何處理，只加LPS的用作陰性對照。孵育24h后，取出96孔板，然后從96孔板各孔中分別取出各組細胞上清液50μL，轉(zhuǎn)移至新的96孔板并向所有孔中分別加入50μL Griess試劑（25g/L），室溫下反應(yīng)10min，用酶標儀于570nm波長測量吸光度。計算公式如下：

NO抑制率（%）=加藥孔OD值/陰性對照孔OD值×100

3 結(jié)果與分析

3.1 檳榔多糖的含量 采用苯酚—硫酸法檢測檳榔多糖的含量，其葡萄糖標準液的標準曲線如圖1所示。由圖1可知，在該試驗和儀器條件下，吸光度和質(zhì)量濃度的關(guān)系為Y=0.0088X+0.0251，R2=0.9951（Y為吸光度，X為標準溶液質(zhì)量濃度，mg/L）。

3.2 超聲波輔助提取法工藝條件對提取檳榔多糖得率的影響 目前，超聲波提取技術(shù)已廣泛應(yīng)用于對各種食品和中藥等原料中的有效成分的提取中[13]。超聲功率、溫度、時間、溶劑類型、溶液濃度、料液比、顆粒大小等工藝條件是超聲波提取工藝過程中主要考察的因素[14]。本試驗考察了超聲功率、時間和液料比對檳榔多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：當(dāng)提取功率為270～540W時，檳榔多糖的提取率逐漸增加，并達到最大值。因為超聲波產(chǎn)生的物理效應(yīng)，促使細胞壁破碎，加快多糖的溶出。在提取超聲功率達到540W時，檳榔多糖的提取率達到最大，之后功率進一步增加，但是提取率卻減少，這可能是由于隨著超聲波功率的加大，空化作用和機械作用加大，引起了多糖物質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞。因此，選定540W為最優(yōu)提取超聲功率。液料比也是影響活性物質(zhì)提取率的重要因素。當(dāng)液料比從15mL/g增加到20mL/g時，檳榔多糖提取率逐漸升高，原因可能是溶劑過少時，不利于多糖的溶出。當(dāng)液料比從20mL/g增加到35mL/g時，檳榔多糖提取率基本無變化，說明多糖的溶出與損耗已經(jīng)達到一定的平衡。綜合考慮濃縮時間和耗費的成本，最適宜的料液比為20mL/g。提取時間方面，隨著提取時間的延長，檳榔多糖提取率呈先增大后降低的趨勢，當(dāng)提取時間達到480s時，檳榔多糖的得率達到最大值;當(dāng)提取時間超過480s時，檳榔多糖的提取率開始降低。因此，最適提取時間為480s。

3.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

3.3.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型 依據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計原理，在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以超聲時間X1，超聲溫度X2，液料比X33個因素為自變量，檳榔多糖得率Y（%）為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件做3因素3水平響應(yīng)面分析試驗設(shè)計，共17個實驗點，響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2。對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到了可以描述檳榔多糖得率Y與3個自變量的數(shù)學(xué)模型方程，如下所示：

由表3可知，回歸模型極顯著（P<0.0001）、失擬不顯著（P=0.3691），說明未知因素對實驗結(jié)果影響很小，預(yù)測的回歸模型與實驗結(jié)果擬合得較好。而且預(yù)測模型的 R2=0.9951，說明多糖提取率的實驗值與預(yù)測值之間一致性較好，該模型的變異系數(shù)CV=0.49%<5%，校正系數(shù) R2Adj=0.9887，說明預(yù)測的模型能反映98.87%響應(yīng)值的變化，因此通過回歸方程能夠預(yù)測并分析實驗真實數(shù)據(jù)。通過表3中的方差分析結(jié)果可知，各單因素對檳榔提取率影響顯著，其影響大小順序為提取功率>提取時間>液料比，而單因素之間的交互作用對提取率的影響不顯著（P>0.05）。

3.3.2 響應(yīng)面圖形 通過Box-Behnken實驗得到的多元回歸模型所作的響應(yīng)曲面圖見圖3，響應(yīng)面圖能夠直觀地反映各因素之間的交互關(guān)系，曲面越陡峭，說明該因素對響應(yīng)值的影響越顯著，從圖中的等高線密集程度可看出對產(chǎn)率的影響，越密集說明影響越顯著，越稀疏表明影響越小。可見，提取功率所對應(yīng)的曲面最為陡峭，提取時間所對應(yīng)的曲面最為平滑，這說明提取功率對檳榔多糖提取率的影響最顯著，提取液料比的影響最小。

3.3.3 最優(yōu)提取條件的預(yù)測及結(jié)果合理性驗證 對進一步分析，得到超聲波提取檳榔多糖的最優(yōu)參數(shù)是：提取功率630W，提取液料比20.76mL/g，提取時間501.34s，預(yù)測檳榔多糖提取率為3.3147%。為了實際操作方便，理論優(yōu)化條件優(yōu)化為提取功率630W，提取液料比20.76mL/g，提取時間501s，在此條件下，進行3組實驗，檳榔多糖實際提取率為（3.3206±0.0099）%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)是可靠的。

3.4 檳榔多糖對RAW264.7細胞存活率的影響 如圖4所示，檳榔多糖在20、40、60、80、100μg/mL5個濃度劑量下，單獨作用處理24h后，與正常對照組相比，對小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7存活率無顯著影響（P<0.05），這表明在此濃度范圍內(nèi)，檳榔多糖對細胞無毒性作用。

3.5 檳榔多糖對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細胞產(chǎn)生的一氧化氮含量的影響 炎癥是機體對致炎物質(zhì)的刺激產(chǎn)生的防御性反應(yīng)[15]。脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞RAW264.7已被廣泛用于各種物質(zhì)的抗炎作用評價[16]。由圖5可知，在20～100μg/mL濃度范圍內(nèi)，檳榔多糖有較好的抑制小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生NO的作用，并隨多糖濃度升高，其抑制NO分泌作用增強，即在實驗測定范圍內(nèi)，檳榔多糖對細胞模型內(nèi)NO的抑制作用具有濃度依賴性;繪制質(zhì)量濃度-抑制率曲線，經(jīng)計算得半數(shù)抑制濃度（IC50）為85.64μg/mL。

4 結(jié)論

超聲波在多糖提取過程中，利用空化作用和機械效應(yīng)破壞生物細胞壁，加速浸提物的溶出，從而提高了多糖得率[17]。本試驗得到了超聲波提取檳榔多糖的最佳工藝條件，即提取功率630W，提取液料比20.76mL/g，提取時間501s。在此條件下，檳榔多糖實際提取率為（3.3206±0.0099）%。并且對檳榔多糖的抗炎活性進行了初步篩選，結(jié)果表明，在20～100μg/mL，檳榔多糖對RAW264.7無毒副作用，且對LPS誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生具有一定的抑制作用。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項目：海南省自然科學(xué)資金項目（20163154）;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項項目（1630152017017）。

作者簡介：唐敏敏（1984—），女，山東泰安人，碩士，副研究員，研究方向：功能性食品。? ? 收稿日期：2019-03-25