柴 華，宋 揚(yáng)，李 贄，藏玉婷，劉鑫瑩，李應(yīng)鶴，武 嘯

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱 150069）

1 試驗(yàn)材料

1.1 疫苗

雞新城疫、禽流感（H9亞型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+TJ株+HY株）：批號(hào)：201501，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備。

1.2 檢驗(yàn)用強(qiáng)毒

雞新城疫病毒北京強(qiáng)毒株（CVCC AV1611株），批號(hào)NDV-AV1611-QD（E1，病毒含量：107.63ELD50/0.1 mL）；H9亞型禽流感病毒TJ株，批號(hào)：AIV（H9）-TJ-QD-01（E1，病毒含量：108.63EID50/0.1 mL）；Ⅰ群4型禽腺病毒HY株，批號(hào)：FAV-HY-QD-01（F2，病毒含量：107.26TCID50/0.1 mL），均由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備、鑒定、保管和供應(yīng)。

1.3 血凝抑制試驗(yàn)抗原

雞新城疫病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原：抗原批號(hào)：NDV-La Sota-K-06，HA效價(jià)1∶1024，規(guī)格：2.0 mL·瓶-1，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備。

H9亞型禽流感病毒血凝抑制試驗(yàn)抗原，抗原批號(hào)：AIV（H9）-TJ-K-01，HA效價(jià)1∶512，規(guī)格：2.0 mL·瓶-1，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備。

Ⅰ群4型禽腺病毒瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原，抗原批號(hào)：FAV-HY-K-01，瓊擴(kuò)效價(jià)1∶2，規(guī)格：2.0 mL·瓶-1，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司制備。

1.4 SPF雞

SPF雞由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司五常SPF雞場(chǎng)提供。

1.5 注射器

注射器購(gòu)自上海達(dá)美醫(yī)用塑料廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 新城疫病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)

將30日齡SPF雞60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，1～5組分別頸部皮下免疫三聯(lián)滅活疫苗10、20、50、150μL·只-1和0.5 mL·只-1，6組不免疫作為攻毒對(duì)照。各組免疫后21 d，分別采血，分離血清，測(cè)定新城疫病毒HI效價(jià)。根據(jù)效價(jià)重新分組，連同對(duì)照組各肌肉注射新城疫強(qiáng)毒AV1611株病毒液，0.1 mL·只-（1含105.0ELD50），觀察14 d，記錄試驗(yàn)雞的死亡情況，計(jì)算攻毒保護(hù)率。

2.2 禽流感病毒（H9亞型）抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)

將21日齡SPF雞60只，隨機(jī)分成6組，每組10只，1～5組分別頸部皮下免疫三聯(lián)滅活疫苗0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL·只-1；6組不免疫作為攻毒對(duì)照。各組免疫后21日，分別采血，分離血清，測(cè)定禽流感病毒（H9亞型）HI效價(jià)。根據(jù)效價(jià)重新分組，連同對(duì)照組各靜脈注射H9亞型禽流感病毒TJ株0.1 mL（含107.0EID50），攻毒后第5日，采集每只雞的泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離。將每只雞的樣品經(jīng)尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5枚。孵育觀察5日，無(wú)論死胚、活胚均應(yīng)測(cè)定雞胚液血凝價(jià)，計(jì)算攻毒保護(hù)率。

2.3 Ⅰ群4型禽腺病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)

將21日齡SPF雞40只，隨機(jī)分成4組，每組10只，1～3組分別頸部皮下免疫三聯(lián)滅活疫苗0.2、0.5和1.0 mL·只-1；4組不免疫作為攻毒對(duì)照。各組免疫后21日，分別采血，分離血清，測(cè)定Ⅰ群4型禽腺病毒瓊擴(kuò)抗體效價(jià)。根據(jù)效價(jià)重新分組，連同對(duì)照組各肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒HY株病毒液，每只0.1 mL（含106.0TCID50）。連續(xù)觀察10日，記錄結(jié)果，計(jì)算攻毒保護(hù)率。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 新城疫病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)

新城疫病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，新城疫病毒HI抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)率呈正相關(guān)：HI≤2log2，攻毒保護(hù)率為0；HI=3log2，攻毒保護(hù)率為57.1%；HI≥4log2，攻毒保護(hù)率為100%。

3.2 禽流感病毒（H9亞型）抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)

禽流感病毒（H9亞型）抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，禽流感病毒（H9亞型）HI抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)率呈正相關(guān)：HI≤3log2，攻毒保護(hù)率為0；HI=4log2，攻毒保護(hù)率為83.3%；HI=5log2，攻毒保護(hù)率為88.9%；HI≥6log2，攻毒保護(hù)率為100%。

3.3 Ⅰ群4型禽腺病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)

Ⅰ群4型禽腺病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，Ⅰ群4型禽腺病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)率呈正相關(guān)：當(dāng)抗體瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶1時(shí)，攻毒保護(hù)率為90%；當(dāng)抗體瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶2時(shí)，攻毒保護(hù)率為100%；當(dāng)抗體瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶4時(shí)，攻毒保護(hù)率為100%。

表1 新城疫病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

表2 禽流感病毒（H9亞型）抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

表3 I群4型禽腺病毒抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

雞新城疫、禽流感（H9亞型）、禽腺病毒（Ⅰ群，4型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+TJ株+HY株）各組抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)均呈正相關(guān)，疫苗各組抗體效價(jià)可代替動(dòng)物效檢試驗(yàn)。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果及我國(guó)獸藥標(biāo)準(zhǔn)，將三聯(lián)滅活疫苗血清標(biāo)準(zhǔn)確定為：30日齡雞皮下注射疫苗20μL（1/25羽份），21日后測(cè)定新城疫病毒HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)≥1∶16；21日齡雞皮下注射疫苗0.5 mL，21日后測(cè)定禽流感（H9亞型）病毒HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)≥1∶128；Ⅰ群4型禽腺病毒抗體效價(jià)≥1∶1[1-4]。