周羅琴，田宏現(xiàn)

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

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峨嵋雙蝴蝶植物提取物的抗五步蛇毒作用

周羅琴，田宏現(xiàn)

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

摘要：研究峨嵋雙蝴蝶植物水提物的抗五步蛇毒作用.建立小鼠五步蛇毒中毒模型，觀察小鼠的中毒表現(xiàn)，并統(tǒng)計(jì)小鼠的死亡率，比較小鼠組織出血、組織壞死及組織潰瘍狀況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，峨嵋雙蝴蝶植物水提物給藥組動(dòng)物的死亡率較模型組的明顯下降，局部和全身癥狀較輕，而且隨著劑量的增加癥狀顯著減輕，尤其是對(duì)于組織的保護(hù)作用比較明顯.峨嵋雙蝴蝶植物水提物具有抗五步蛇毒作用，能降低蛇毒毒性.

關(guān)鍵詞：雙蝴蝶提取液；五步蛇；抗毒性；保護(hù)率

五步蛇又稱尖吻蝮、蘄蛇等，是中國重要10大毒蛇之一.五步蛇個(gè)體大，毒液多，其蛇毒中含有纖溶酶、凝血酶樣酶、蛋白水解酶、出血因子等20余種蛋白質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致傷后發(fā)病急劇，變化迅速，對(duì)血液及循環(huán)系統(tǒng)破壞尤為明顯，屬于循環(huán)毒，易造成廣泛出血、溶血和組織壞死，如不及時(shí)救治，容易造成傷肢致殘，甚至危及生命[1-4].現(xiàn)在治療五步蛇毒的藥相繼問世，除常規(guī)抗五步蛇毒血清和季德勝蛇藥外，還有蛇傷1號(hào)合劑[5]、青龍蛇藥[6]、A草蛇藥片[7]等以中草藥為主的單方及驗(yàn)方.傳統(tǒng)中藥治療蛇傷歷史悠久，積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)提高人體的抗蛇毒能力、泄毒排毒、消除中毒癥狀、減少組織損傷具有獨(dú)到的功效.常用治療蛇毒的中草藥通常有清熱解毒、通腑泄火、涼血止血等功能，具抗菌消炎、改善微循環(huán)等作用，如黃蓮、半支蓮、丹皮、丹參、三七粉、地耳草、地膽頭、崗梅根、半夏、天南星等[8-10].

筆者對(duì)峨嵋雙蝴蝶(Tripterospemumcordatum)植物提取液對(duì)抗五步蛇毒的作用進(jìn)行了研究.峨嵋雙蝴蝶，雙蝴蝶屬，別名肺形草、黃金錢，屬于龍膽科多年生常綠纏繞草本.全球大約17種，中國有15種，其中中國臺(tái)灣分布2種，它們都具有相似的形態(tài)和利用價(jià)值，主要分布于湖南省、湖北省、重慶市、四川省、貴州省、云南省等地區(qū).中醫(yī)書記載，峨嵋雙蝴蝶性寒、味甘辛，具有潤肺止血、清熱利尿、解毒、消腫等功能[11].有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[12]表明，從Tripterospemum中提取的Terahydoxy xanthone(THXS)對(duì)鼠科動(dòng)物的白血病毒的反轉(zhuǎn)錄具有強(qiáng)烈的抑制作用；也有臺(tái)灣學(xué)者[13]實(shí)驗(yàn)證明，TripterospemumLanceolatum中的Norathyrial對(duì)循環(huán)系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥有明顯的抑制功能；體外實(shí)驗(yàn)[14]也證明它有較好的抑菌活性；還有文獻(xiàn)[15]記載它作為治療蛇傷的中草藥.

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，購于昆山市超聲儀器有限公司；RE52-99蒸發(fā)器，購于上海市亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，購于鄭州市長城科工貿(mào)有限公司；MDF-V2086S低溫冷凍干燥機(jī)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠研制，由北京市四環(huán)科學(xué)儀器廠提供.

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)BACB/C小白鼠數(shù)只，雌雄兼用，體重18~23 g，由廣州市中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心提供；KM種小鼠，體重18~22 g，購于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.1.3 實(shí)驗(yàn)植物及藥物峨嵋雙蝴蝶采集于湖南省懷化市中方縣.取全草洗凈，自然陰干；稱干重536 g浸泡于6 500 mL水中24 h，通過低溫(60 ℃)超聲波抽提2 h，過濾.濾渣加入1 250 mL水第2次抽提，過濾后再收集濾渣加入1 000 mL水和800 mL水重復(fù)抽提第3、第4次，第2到第4次抽提時(shí)間分別為1 h.最后共收集濾液6 500 mL，合并濾液通過蒸發(fā)器濃縮至600 mL.將得到的濃縮液用低溫冷凍干燥機(jī)干燥，得浸膏粉末113 g,放置冰箱中保存?zhèn)溆?臨用前加蒸餾水稀釋至所需實(shí)驗(yàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)).

1.1.4 蛇毒純化干粉，購于廣州市養(yǎng)蛇場(chǎng).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 峨嵋雙蝴蝶水提物動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)因預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該藥物毒性過低，LD50無法測(cè)出，故進(jìn)行最大耐受量實(shí)驗(yàn).小鼠口服灌胃最大耐受量實(shí)驗(yàn)：選用18~22 g健康KM種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)抽取，均勻分組，給藥組與對(duì)照組各20只，分籠飼養(yǎng)2 d，實(shí)驗(yàn)前16 h禁食.給藥組按一次性灌胃給藥，所配制的藥液每毫升含峨嵋雙蝴蝶水提物0.55 g(最大溶解度)，小鼠灌胃容積為0.04 mL/g(最大容積)，小鼠給藥量為峨嵋雙蝴蝶水提物22.0 mg/g，合生藥為79.3 mg/g.對(duì)照組給等量的生理鹽水0.04 mL/g，觀察7 d.結(jié)果給藥組與對(duì)照組均未見異常，12 h內(nèi)健在，72 h后處死解剖尸體驗(yàn)心、肺、肝、脾、腎等臟器，肉眼未見異常.結(jié)論：小鼠灌胃給藥峨嵋雙蝴蝶水提浸膏粉的最大耐受量(MTD)為22.0 mg/g，合生藥為79.3 mg/g，相當(dāng)于人臨床用量的165倍.

1.2.2 五步蛇毒致死劑量和時(shí)間的確定為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用序貫法(上下法)計(jì)算LD50，缺點(diǎn)是動(dòng)物必須逐個(gè)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，下一只動(dòng)物用藥劑量又決定于上一只動(dòng)物的反應(yīng)情況，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，而它適合急性致死藥物的動(dòng)物實(shí)驗(yàn).選用10只18~22 g健康小白鼠，雌雄各半，隨機(jī)抽取.分別配制好4種不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的五步蛇毒生理鹽水注射液，通過預(yù)試驗(yàn)確定劑量分組，在本實(shí)驗(yàn)中即為2.5，2，1.5，1 μg/g這4種.實(shí)驗(yàn)先從較大劑量開始，第1只動(dòng)物用五步蛇毒生理鹽水注射后，如果發(fā)生死亡，在表中以“+”記錄，下一只動(dòng)物就降低一級(jí)劑量注射；相反，如果動(dòng)物存活，在表中以“-”記錄，下一只動(dòng)物就用高一級(jí)的劑量；依此類推.最后1只動(dòng)物雖未進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但在表格內(nèi)仍占位置，以“×”符號(hào)表示.本方法所用動(dòng)物總數(shù)∑n也應(yīng)事先定好，一般∑n=10即可獲得滿意的結(jié)果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，其中：D為蛇毒致死劑量實(shí)驗(yàn)組；S(safe)為存活數(shù)；F(fatal)為死亡數(shù);n(number)為劑量組的動(dòng)物數(shù)；X=logD，即劑量的對(duì)數(shù).

表1　五步蛇毒半數(shù)致死劑量(LD50)的實(shí)驗(yàn)

根據(jù)致死劑量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇健康的BACB/C小白鼠數(shù)只，體重為18~22 g,雌雄各半，隨機(jī)抽取分組.按1.6 μg/g蛇毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)加3 mL的生理鹽水(0.32 g/L)配成注射液注射小鼠(0.1 mL/只).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射蛇毒后能使動(dòng)物致死時(shí)間控制在6 h左右，符合本實(shí)驗(yàn)時(shí)間規(guī)定要求(3~8 h)，因此確定為本實(shí)驗(yàn)的注射質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.2.3 小白鼠中毒模型建立將BACB/C小白鼠隨機(jī)分配為峨嵋雙蝴蝶植物水提物低、中、高劑量組及空白組、模型組(五步蛇毒中毒損傷組)，各組小白鼠15只.峨嵋雙蝴蝶植物水提物低、中、高劑量組給予峨眉雙蝴蝶植物水提浸膏(分別為成人用量的1.5，3，5倍)，空白組和模型組給予相同劑量的生理鹽水.以上各組動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)前禁水16 h，各實(shí)驗(yàn)組按每只0.5 mL的劑量灌胃，連續(xù)7 d給藥，每日給藥1次.除空白組外，各組小鼠均于末次給藥后1 h，于每只腹腔注射五步蛇毒100 μg，建立小鼠五步蛇毒中毒模型.

1.2.4 小白鼠中毒表現(xiàn)觀察注射蛇毒后由實(shí)驗(yàn)人員輪流24 h觀察，記錄各組動(dòng)物各個(gè)時(shí)間段內(nèi)的局部癥狀以及呼吸、食欲、活動(dòng)等全身狀況，以動(dòng)物的死亡數(shù)累計(jì)各組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.計(jì)算各組動(dòng)物死亡率和保護(hù)率(模型組死亡率-給藥組死亡率=保護(hù)率).按死亡率的百分率顯著性檢測(cè)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[16].24 h后解剖各實(shí)驗(yàn)組小鼠，觀察其組織出血量，組織壞死面積以及潰瘍發(fā)生面積，各指標(biāo)程度的輕重用“+”的個(gè)數(shù)表示，越多表示程度越重.

2結(jié)果與討論

2.1 中毒表現(xiàn)

除空白組外，各組小鼠從注射五步蛇毒數(shù)分鐘后，注射部位充血開始，表現(xiàn)為呼吸急促，眼睛瞳孔縮小，全身縮成一團(tuán)，行動(dòng)緩慢，并均有不同程度的嗜睡、懶動(dòng)等癥狀.這些癥狀模型組動(dòng)物表現(xiàn)得更為明顯，該組死亡10只，死亡動(dòng)物都有肛門出血等現(xiàn)象.各劑量組注毒后也出現(xiàn)一些死亡，但并發(fā)癥狀比模型組所表現(xiàn)的程度輕.3h后可以看到注射部位充血嚴(yán)重，局部皮膚均出現(xiàn)紫紺、潰爛如燙傷樣.

2.2 死亡率和保護(hù)率

由表2可以看出，各劑量組都表現(xiàn)了不同程度的保護(hù)情況，尤其是高劑量組的峨嵋雙蝴蝶浸膏溶液對(duì)五步蛇毒抗性明顯，保護(hù)率高達(dá)60%，死亡率明顯降低.這說明高劑量的峨嵋雙蝴蝶浸膏溶液具有較強(qiáng)的抗五步蛇毒性的作用.

表2　不同劑量藥物對(duì)中毒小鼠的保護(hù)情況

2.3 組織壞死對(duì)比

動(dòng)物中毒死亡后，將各劑量組和模型組動(dòng)物取樣解剖，與正常健康小鼠(空白組)解剖做對(duì)比實(shí)驗(yàn).健康小鼠血液鮮紅、血流正常，肝、腎、脾等內(nèi)臟無充血等異?，F(xiàn)象.而中毒小鼠局部注射部位潰爛，出現(xiàn)結(jié)痂

表3　局部注射蛇毒后各組織中毒程度對(duì)比

注以上表現(xiàn)程度輕重由“+”多少來表示.并形成血腫塊，解剖臟器均有不同程度的充血，血液呈黯紅，血流緩慢，嚴(yán)重的情況肉眼可見肝臟壞死.解剖前后還對(duì)各劑量組和模型組的中毒狀況作了對(duì)比，觀察各組小鼠的中毒情況，并做詳細(xì)記錄.表3示出以各組注毒后所出現(xiàn)的局部肌肉組織的出血、壞死和潰瘍情況為例，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的峨眉雙蝴蝶植物水提浸膏對(duì)抗五步蛇毒的結(jié)果.

由表3可知，模型組中毒動(dòng)物出血很少，原因是組織充血開始，局部皮膚有瘀斑，出現(xiàn)不同程度的壞死、潰爛，血液流動(dòng)緩慢；而各劑量組隨著藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，中毒程度呈減輕趨勢(shì).特別是高劑量組受藥物保護(hù)后，對(duì)中毒小鼠的組織壞死與潰瘍情況保護(hù)明顯，血液外流速度與健康小鼠無異常.這說明峨嵋雙蝴蝶浸膏溶液具有抗五步蛇毒之功效，并對(duì)組織壞死有明顯保護(hù)作用.

3結(jié)語

在中國，用中草藥治療蛇傷的歷史悠久.例如民間收集了一些具有抗蛇毒作用明顯的中草藥單方、驗(yàn)方，如廣東蛇藥、廣西蛇藥、群生蛇藥、熊山蛇藥、毛蘿藦注射液、A草蛇藥片等[17]，這些藥方材料易得，療效顯著.本實(shí)驗(yàn)提取天然植物峨眉雙蝴蝶其有效成分制成浸膏，配成不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的藥劑溶液進(jìn)行對(duì)抗五步蛇毒實(shí)驗(yàn).結(jié)果表明，峨眉雙蝴蝶浸膏溶液能明顯改善蛇毒中毒癥狀，并隨著浸膏溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，中毒組織癥狀呈減輕趨勢(shì)，尤其是以成人劑量的5倍給藥，可降低五步蛇毒中毒小白鼠的死亡率，說明峨眉雙蝴蝶浸膏溶液對(duì)中五步蛇毒的動(dòng)物具有明顯的保護(hù)作用.

從本實(shí)驗(yàn)來看，峨眉雙蝴蝶植物水提物具有緩解蛇毒擴(kuò)散、控制病情發(fā)展、提高療效的作用，但是它對(duì)抗蛇毒的具體化學(xué)成分還不清楚，有待進(jìn)一步研究.雙蝴蝶屬植物中除齊墩果酸和芒果甙外，有資料表明還有2種酸類物質(zhì)(oleanolicacid和norathyriol).對(duì)峨嵋雙蝴蝶的分析表明，其齊墩果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)1.51 mg/g[18].然而，近幾年來，對(duì)民間具有抗蛇毒作用的中草藥進(jìn)行研究的結(jié)果表明：抗蛇毒有效成分為有機(jī)酸，并且藥理實(shí)驗(yàn)證明有機(jī)酸鉀鈉鹽的保護(hù)作用要比游離的有機(jī)酸強(qiáng).因此，可以認(rèn)為此類植物與其他中草蛇藥一樣富含多種有機(jī)酸，當(dāng)然也并不是所有的功能都由有機(jī)酸來體現(xiàn)，其他成分如糖、黃酮甙等同樣能增強(qiáng)有機(jī)酸的保護(hù)作用.另外，除了有機(jī)酸，藥物中的無機(jī)成分也起到協(xié)同作用，因?yàn)閱我唤M分的抗蛇毒效果遠(yuǎn)不如與其他成分協(xié)同之下所起作用顯著[19]，因此峨眉雙蝴蝶抗蛇毒的有效成分量效關(guān)系及與其他成分協(xié)同作用的解毒機(jī)理有待進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯向陽潔)

Antitoxic Effect of Extracts of Tripterospemum Cordatum Against

DeinagkistrodonAcutusSnake Venom

ZHOU Luoqin,TIAN Hongxian

(College of Biology & Environmental Science,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China)

Abstract:The antitoxic effect of Tripterospemum cordatum aqueous extracts against Deinagkistrodon acutus snake venom is researched.The BACA/C mice were divided into five group according to the dosage of Tripterospemum cordatum aqueous extracts applied:low dosage,middle dosage,high dosage,blank group and model group,each group of health conditions being observed after 7￣days intra￣gastric administration.For the last time of administration,each group was intraperitoneally injected with Agkistrodon acutus snake venom after one hour later,then the mice’s poisoning performance was observed and the death rate was calculated,and each group of mice’s tissue bleeding,death and ulceration compared.The results showed that the aqueous extract of Tripterospemum cordatum at the low dosage,middle dosage and high dosage all reduced the mortality caused by Agkistrodon acutus snake venom poisoning and relieved some symptoms;with the increase of the dosage the symptoms decreased significantly,and the protection effect on the tissue was especially apparent.It can be concluded that the aqueous extract of Tripterospemum cordatum has antitoxic effect against Agkistrodon acutus snake venom and decrease the toxicity.

Key words:extracts of Tripterospemum;Deinagkistrodon acutus;antitoxic;protective rate

通信作者：田宏現(xiàn)(1953—),男,湖南保靖人,吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院教授,博士,主要從事微生物學(xué)和林業(yè)生物技術(shù)研究.

作者簡(jiǎn)介：周羅琴(1987—),女,湖南邵陽人,吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生,主要從事植物學(xué)研究

收稿日期：2015-01-17

中圖分類號(hào)：R996.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

DOI:10.3969/j.cnki.jdxb.2015.03.019

文章編號(hào)：1007-2985(2015)03-0090-04