欒 穎， 梁晉剛,2， 周曉莉， 張正光*

1南京農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，江蘇 南京 210095； 2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)及技術(shù)原理

RNAi(RNA interference)即RNA干擾，是由雙鏈RNA(dsRNA)誘導的同源mRNA高效特異性降解，造成轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)，影響靶標生物的正常生理活動或死亡的現(xiàn)象。Guo & Kemphues(1995)發(fā)現(xiàn)正義RNA與反義RNA都能抑制線蟲Caenorhabditiselegans的基因表達，這個結(jié)果與反義RNA技術(shù)理論不符。后來，F(xiàn)ireetal.(1998)發(fā)現(xiàn)Guo和Kemphues的實驗中正義RNA抑制基因表達是由于污染了微量的dsRNA，即為RNAi現(xiàn)象。隨后，科學家又在多種真核生物中發(fā)現(xiàn)了由dsRNA介導的RNAi現(xiàn)象。

RNAi起始階段會產(chǎn)生RNAi的標志性組分——小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)和另一種調(diào)控基因表達的非編碼小RNA microRNA(miRNA)。基本的RNAi過程可以分為3個主要步驟(Tomari & Zamore,2005)。首先，Dicer(一種RNaseⅢ核酶)將在細胞中表達或引入細胞的內(nèi)源或外源dsRNA分子，加工成小RNA雙鏈體。根據(jù)生物體的不同，可能有一個或多個Dicer酶，每個酶負責不同類型的dsRNA產(chǎn)物(Meister & Tuschl,2004)。例如，在黑腹果蠅DrosophilamelanogasterMeigen中，Dicer-1主要用于產(chǎn)生miRNA，而Dicer-2則負責將長dsRNAs加工成siRNA (Leeetal.,2004)。其次，這些雙鏈體被解鏈，其中一條被稱為引導鏈的單鏈RNA(ssRNA)被優(yōu)先加載到RNA誘導沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)的蛋白質(zhì)復合物中。再次，RISC復合體識別與dsRNA完全或部分序列同源的潛在靶信使RNA(mRNA)，引導鏈促使RISC的內(nèi)切核酸酶將mRNA裂解，最終導致目的基因沉默。

RNAi作為一種新的基因阻斷技術(shù)，具有高度特異性、高效性、持久性和信號的可傳導性等特點(李麗文等,2007)，能夠簡單并高效地抑制特定基因的表達。目前主要應(yīng)用于以下幾個方面：(1)基因敲除，傳統(tǒng)的基因敲除是反向遺傳學的研究手段，技術(shù)難度高、周期長、操作困難，而RNAi技術(shù)可利用siRNA或siRNA表達載體快速、簡便地抑制目的基因的表達，并能使在體外培養(yǎng)的細胞中達到基因敲除的效果；(2)基因功能分析，RNAi技術(shù)克服了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)苛刻繁瑣的缺點，不僅可以用于結(jié)構(gòu)基因的功能研究，還可用于細胞周期調(diào)控、代謝、信號轉(zhuǎn)導、膜轉(zhuǎn)運以及DNA損傷反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄或甲基化等多方面的基因功能研究；(3)基因治療，用于抑制癌細胞的基因表達；(4)調(diào)控信號轉(zhuǎn)導通路，RNAi已經(jīng)被證實能誘導植物干細胞的分化；(5)病毒感染治療。RNAi技術(shù)可以干擾病毒的復制及相應(yīng)蛋白質(zhì)的翻譯，有效地控制病毒的繁殖和傳播(周紅建等,2010)。

2 RNAi技術(shù)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的區(qū)別

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用分子生物學和基因工程技術(shù)將外源基因插入、整合到受體植物的基因組中，并使其在后代植株中得以遺傳和表達，從而使受體植物獲得新的性狀。無論過程還是最終產(chǎn)品，都涉及外源重組DNA的導入及整合，且外源DNA在親本作物中的插入位點是隨機的。由于大部分產(chǎn)品轉(zhuǎn)入的都是外源基因，需要進行蛋白表達，因此，插入位點的不同會對外源蛋白表達效率以及受體作物本身的蛋白表達產(chǎn)生潛在影響。對于RNAi轉(zhuǎn)基因作物來說，插入位點的不同并不會導致RNA轉(zhuǎn)錄的差異，且該過程不涉及外源蛋白的表達(焦悅等,2018)。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物是靠Bt蛋白來控制靶標害蟲。Bt蛋白是革蘭氏陽性土壤細菌蘇云金桿菌產(chǎn)生的一種具有高度特異性的殺蟲蛋白，這種蛋白被靶標昆蟲取食后在中腸溶解為前毒素，再被蛋白酶水解為毒素分子，毒素分子與中腸細胞結(jié)合使細胞膜穿孔，最終導致昆蟲死亡(林珠鳳等,2015)。Bt蛋白生物制劑迄今仍是世界上生產(chǎn)與應(yīng)用規(guī)模最大的微生物殺蟲劑。與其他生物殺蟲劑一樣，Bt生物制劑也有藥效慢、持效期短、易受環(huán)境影響、成本高等缺陷與不足，這是制約其大面積推廣應(yīng)用的主要因素(陸宴輝和梁革梅,2016)。

研究表明,RNAi技術(shù)相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)有很大的優(yōu)勢，主要包括：(1)高度特異性，dsRNA介導的RNAi只能特異性地降解同源mRNA，并不影響其他mRNA的表達，因此，RNAi技術(shù)應(yīng)用于抗蟲作物上時只會針對特定的一種或幾種靶標生物，而傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)突變的隨機性很大；(2)高效性，尤其是對一些鞘翅目昆蟲(Zottietal.,2018)，少量的dsRNA就可以抑制大量同源mRNA的表達，比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)節(jié)約了大量人力并縮短了時間；(3)RNAi轉(zhuǎn)基因植物表達的不是蛋白而是dsRNA和siRNA，這種表達形式易于在農(nóng)作物中推廣，因為插入到植物基因組上的外源基因干擾序列部分的mRNA轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并被植物體內(nèi)的Dicer識別降解，不會再被翻譯成蛋白質(zhì)，從而避免了外源蛋白質(zhì)在植株體內(nèi)的積累，具有較高的生物安全性。作為調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和保持遺傳穩(wěn)定性的重要機制，植物存在大量的內(nèi)源dsRNA和siRNA，因此，表達與植物自身無同源序列的 dsRNA，不會對寄主植物產(chǎn)生不良的影響，也更易被寄主植物接受(郭強等,2012)。綜上所述，RNAi技術(shù)具有重要的生物學意義，在農(nóng)作物害蟲防治領(lǐng)域有廣闊的前景。

近幾年來，人們將RNAi技術(shù)大量地應(yīng)用到了農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。在作物改良方面，高夢燭等(2016)通過構(gòu)建RNAi膜蛋白載體并導入到轉(zhuǎn)基因擬南芥ArabidopsisthalianaHeynh中，從而提高了擬南芥的抗寒性，Wangetal.(2017)通過RNAi篩選出與剛毛檉柳TamarixhispidWilld的耐鹽性相關(guān)的基因；在害蟲防治方面，李嬌(2016)通過注射dsRNA沉默幾丁質(zhì)合成酶A基因從而來控制稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisGuenee，Yangetal.(2017)利用RNAi技術(shù)敲除褐飛虱NilaparvatalugensStal體內(nèi)的基因TPS1和TPS2，導致30%的昆蟲死亡；在病害防治方面，黃靜等(2017)通過RNAi提高了番木瓜對環(huán)斑病毒的抗性；在昆蟲抗藥性方面，Guoetal. (2015)利用RNAi技術(shù)沉默了小菜蛾P(guān)lutellaxyllostellaL.的轉(zhuǎn)運蛋白基因，降低了其對CryiAc毒素的敏感性，從而影響小菜蛾的抗藥性。目前已通過RNAi技術(shù)有效防控的主要昆蟲見表1。

表1 目前已通過RNAi技術(shù)有效防控的主要昆蟲Table 1 Major insect pests that have been effectively controlled by RNA interference technology

3 RNAi技術(shù)可能存在的風險

近年來，雖然RNAi已經(jīng)成為作物保護的有效和成功的技術(shù)，但在全面采用該技術(shù)控制有害生物之前還有一些問題要解決。使用基于RNAi的線蟲處理策略的一個主要問題是潛在的脫靶效應(yīng)，即siRNA與非靶標基因RNA發(fā)生互補配對并非特異性地抑制了該基因的表達(尚仁福和吳立剛,2016)。由于RNAi機制以高度序列特異性的方式發(fā)生，與導入的dsRNA分子具有部分同源性的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄物的交叉雜交可能導致非靶基因的沉默，這可能對非靶向生物體產(chǎn)生影響，具有潛在的風險(Duttaetal., 2014)。

3.1 對改良植物本身的風險

3.1.1 dsRNA與作物的轉(zhuǎn)基因蛋白相互作用 轉(zhuǎn)基因抗蟲作物Bt蛋白的作用模式是結(jié)合昆蟲的中腸受體細胞，隨后將細胞穿孔導致細胞裂解(Vachonetal.,2012)，而dsRNA的作用模式是消耗靶mRNA(Kennerdell & Carthew,1998)，這2種作用模式是不相關(guān)的，但Bt蛋白很有可能與dsRNA結(jié)合并在轉(zhuǎn)基因作物中表達。因此，針對Bt蛋白與dsRNA潛在的結(jié)合要進行風險評估。Bachmanetal. (2016)評估了Cry蛋白和dsRNA(Cry3Bb1和玉米根蟲DiabroticavirgiferaLeConte的DvSnf7 dsRNA)之間的潛在相互作用，抗蟲玉米雜交種MON 87411既可以產(chǎn)生抵抗玉米根蟲的Cry3Bb1 Bt蛋白，又可以針對玉米根蟲產(chǎn)生DvSnf7 dsRNA，使玉米根蟲發(fā)生RNA干擾。李翠萍等(2012)、Belden & Lydy (2006)采用了2種方法對這兩者的潛在互作進行了評估，第一種方法是單獨評估Cry蛋白和dsRNA在玉米根蟲內(nèi)的反應(yīng)水平，再將兩者結(jié)合評估，結(jié)果證明兩者組合的反應(yīng)水平是單獨反應(yīng)水平累加的結(jié)果，并且與獨立反應(yīng)下的預(yù)測反應(yīng)水平?jīng)]有顯著差異。第二種方法采用固定的半致死濃度測定法，即將一方的固定亞致死濃度加入到另一方的有效濃度中，測定12 d內(nèi)兩者的半數(shù)致死濃度(LC50)是否有變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cry3Bb1和DvSnf7的LC50均不受對方影響。另外，Levineetal. (2015)用對Cry3Bb1敏感、對DvSnf7不敏感的科羅拉多馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata(Say)測試了Cry3Bb1和DvSnf7之間相互作用的潛力，結(jié)果證明DvSnf7不改變Cry3Bb1的活性。

3.1.2 轉(zhuǎn)基因作物遺傳穩(wěn)定性 轉(zhuǎn)基因作物在不同代際間目的基因的整合和表達能力不盡相同，后代可能發(fā)生可遺傳基因突變(即堿基替換、刪除、插入)，且編碼siRNA基因比編碼蛋白基因的變異率高(Obbardetal.,2009)。因此，應(yīng)分析害蟲的抗性發(fā)展，評估其發(fā)生時間、影響規(guī)模(局部的、區(qū)域的或全國性的)及嚴重程度，并建立預(yù)測模型。此外，只有建立統(tǒng)一的sRNA活性標準才能開展可比性評價，檢測至少3代目的基因表達的穩(wěn)定性和觀察目標性狀表現(xiàn)的穩(wěn)定性(賀煒華等,2008)。

3.2 對靶標生物的風險

轉(zhuǎn)基因作物被靶標害蟲長期食用后，靶標害蟲種群易發(fā)生抗性進化，通過對殺蟲物質(zhì)的螯合或降解，使作用方式中的任何一個步驟無效或目標部位的敏感性降低，可在靶標生物種群中產(chǎn)生抗性導致作物抗蟲的持久性降低。盡管還沒有鑒定出RNAi的抗性機制，但可以假定潛在的抗性機制。如在反應(yīng)鏈中只要存在以下任何一種情況：靶標害蟲攝取的dsRNA減少、消化系統(tǒng)中分子降解導致細胞吸收的dsRNA減少、Dicer酶處理得到的小RNA減少、siRNA分子的RISC復合物識別減少、RISC復合物不能降解目標mRNA或阻斷RNAi的系統(tǒng)擴散等，RNAi轉(zhuǎn)基因作物對靶標生物的抗性就會降低(Fishilevichetal.,2016)。昆蟲還可通過增加目標基因序列的轉(zhuǎn)錄速度或上調(diào)其他與目標(沉默)基因有相同或相似功能的基因來避免基因沉默。

庇護所策略是目前害蟲抗性治理的主要方法(Fittetal.,1994)。庇護所內(nèi)種植的是不包含殺蟲物質(zhì)并允許對殺蟲物質(zhì)敏感的昆蟲存活的作物，對特定性狀沒有選擇壓力，因此，可以保存不具有抗性等位基因的昆蟲。將庇護所和轉(zhuǎn)基因作物混合種植，使敏感個體與轉(zhuǎn)基因植株上的抗性個體隨機交配，從而使它們的后代抗性等位基因是雜合的。如果雜合子產(chǎn)生的后代在轉(zhuǎn)基因抗蟲植株上也不能存活，即達到了治理害蟲的目的(Gould,1998)。

3.3 對生態(tài)環(huán)境的風險

3.3.1 dsRNA在環(huán)境中殘留 RNAi生態(tài)風險評估的一個重要組成部分是確定殺蟲物質(zhì)殘留在環(huán)境中的潛在可能性以及潛在的非目標物種的種群數(shù)量。通過檢測活性殺蟲分子的環(huán)境穩(wěn)定性，可以確定對易感染的非靶標生物是否存在長期風險(Kough & Edelstein,2012)。Dubelmanetal. (2014)針對不同理化性質(zhì)的土壤進行了檢測，并將非靶標生物暴露于dsRNA培養(yǎng)土壤以評估生物活性(即昆蟲死亡率)。結(jié)果表明，在粉砂壤土、壤砂土和黏壤土這3種土壤類型中，玉米根蟲Snf7 dsRNA在48 h后是不可檢測的，Snf7 dsRNA的半衰期小于30 h。很多報道也證實Bt蛋白半衰期在一到幾天范圍內(nèi)(Bryan,2005)，Snf7 dsRNA和其他dsRNA不可能在土壤中持續(xù)存在。如果要證明dsRNA在土壤中的持久性，有必要了解被暴露的黏附生物體是否對dsRNA敏感，同時是否具備必要的加工RNA的分子和與之配對的靶序列。

3.3.2 對非靶標生物的影響 靶標生物攝入的dsRNA對其有高度的特異性(Baumetal.,2007)，然而多個研究表明，序列特異性反應(yīng)會隨著物種之間進化距離和序列間分歧的增加而降低(Whyardetal.,2009)。目前，用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的生態(tài)風險評估為評估RNAi介導的昆蟲保護作物的潛在危害提供了基礎(chǔ)。如針對DvSnf7的dsRNA的致死和亞致死能力在4個目和10個科的昆蟲中進行的評估，結(jié)果表明，DvSnf7的dsRNA殺蟲活性范圍很窄，只有在甲蟲亞科的甲蟲評估中觀察到這種影響，在敏感物種中須滿足一定的序列要求才能與DvSnf7匹配，且在昆蟲中實現(xiàn)RNAi介導的反應(yīng)存在額外的障礙，因此不是所有的物種都對攝入的dsRNA敏感，或在環(huán)境暴露的低濃度下不敏感(Allen & Rd,2012; Bachmanetal.,2013; Huvenne & Smagghe,2010; Tereniusetal.,2011)。因此，評估dsRNA對非靶標生物的影響，可以同時喂食靶標和非靶標生物，重點監(jiān)測與靶標生物序列同源性高而易受感染的生物，并測試RNAi中使用的每種dsRNA對非靶標生物的影響。

4 RNAi技術(shù)的安全評價

目前的科技水平不能預(yù)測RNAi轉(zhuǎn)基因作物對環(huán)境和被人們食用后造成的影響，因此，必須采取一系列嚴格的措施對轉(zhuǎn)基因作物進行全程安全性評價和監(jiān)控管理，維護生態(tài)多樣性，保障人們的人身安全。雖然國際上已有一些經(jīng)驗和數(shù)據(jù)可以借鑒，但仍需對RNAi這項新技術(shù)作出具體分析，以便盡快建立起符合實際需求的安全性評價方法，這樣才能優(yōu)化當前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將RNAi轉(zhuǎn)基因作物進行商業(yè)化種植。

4.1 環(huán)境安全評價

RNAi轉(zhuǎn)基因作物在環(huán)境釋放期間可能會對周邊生態(tài)造成影響，危害當?shù)氐纳鷳B(tài)多樣性。為了貫徹環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的理念，要對轉(zhuǎn)基因作物進行嚴格的環(huán)境安全評價。主要包括：(1)土壤微生物安全評價，RNAi轉(zhuǎn)基因作物在大田種植時，作物本身及其基因產(chǎn)物進入土壤后可能與土壤微生物相互作用，影響土壤中微生物的活動，從而影響土壤肥力；(2)生存競爭力安全評價，RNAi轉(zhuǎn)基因作物中外源基因表達可能具有更強的環(huán)境適應(yīng)能力，將其釋放到生態(tài)環(huán)境中后，與非轉(zhuǎn)基因的作物競爭過程中具有更強的競爭力，可能影響到生物的多樣性，甚至變成新型的雜草(劉華清等,2010)；(3)基因漂移安全評價，RNAi轉(zhuǎn)基因作物的新基因可能會在生態(tài)中發(fā)生基因漂移和與近緣野生種雜交，要針對這2種情況對當?shù)刂参锏纳L情況進行檢測；(4)對非靶標生物的安全評價，RNAi轉(zhuǎn)基因作物可能會對非靶標生物的生存造成影響，因此要監(jiān)測作物周圍的非靶標生物的活性及評價其潛在的影響；(5)靶標生物抗性安全評價，靶標生物可能會不斷進化，淘汰對作物敏感的個體，最終對作物產(chǎn)生抗性，因此要監(jiān)測評估靶標生物不同代的抗性。

4.2 食用安全評價

RNAi轉(zhuǎn)基因作物的食用安全與人類生命安全息息相關(guān)，也是人們最關(guān)注的問題。因此，RNAi轉(zhuǎn)基因作物從實驗室轉(zhuǎn)向大規(guī)模生產(chǎn)之前要實施一系列的食用安全評價。(1)營養(yǎng)學安全評價。檢測RNAi轉(zhuǎn)基因作物中的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維、礦物質(zhì)以及其他與人類健康有關(guān)的營養(yǎng)物質(zhì)，還有凝集素、植酸酶、蛋白酶等抗營養(yǎng)因素與生物堿、毒草等天然毒素，評估這些物質(zhì)的含量與非轉(zhuǎn)基因品種之間是否有顯著性差異。(2)毒理學安全評價。應(yīng)考慮RNAi轉(zhuǎn)基因作物是否會帶來新的毒素或存在產(chǎn)生新毒素的情況。(3)致敏性學安全評價。判斷新基因的來源，根據(jù)基因是否來源于已知的對人體致敏的物種而采取不同的分析步驟。比較氨基酸序列的相似度，再進行特異性血清篩選實驗，然后進行模擬胃腸液消化實驗。建立動物模型實驗，根據(jù)各階段的測試結(jié)果，對RNAi轉(zhuǎn)基因作物致敏性進行評價。(4)非期望效應(yīng)安全評價。RNAi轉(zhuǎn)基因作物可能會出現(xiàn)與預(yù)期效果不符的現(xiàn)象，包括RNAi轉(zhuǎn)基因作物自身可能出現(xiàn)的非期望效應(yīng)，以及食用了轉(zhuǎn)基因食物后，動物在生理上可能存在的非期望變化。目前RNAi轉(zhuǎn)基因作物非預(yù)期效應(yīng)的測定方法包括靶方法和非靶方法2種。(5)腸道健康安全評價。RNAi轉(zhuǎn)基因食物可能會影響腸道微生物菌群從而影響人體健康，目前主要采用亞型分析法非定向檢測腸道微生物，包括微陣列分析基因表達、蛋白雙向電泳和質(zhì)譜、分析蛋白質(zhì)、液譜結(jié)合核磁共振分析化合物等(李媛媛,2017)。

5 RNAi技術(shù)的前景與展望

本文在前人研究RNAi技術(shù)的基礎(chǔ)上進行了一定的補充和完善，介紹了現(xiàn)階段的主要潛在風險以及可行的評估方案，RNAi技術(shù)具有廣闊的農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景，不但可以有效減少害蟲數(shù)量、提高水稻產(chǎn)量、降低種植成本，還可以減少化學農(nóng)藥造成的環(huán)境污染，有利于實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。同時，RNAi技術(shù)也存在一定的生態(tài)風險，雖然RNAi技術(shù)影響生態(tài)安全性的研究已取得了一些進展，但仍存在許多未知領(lǐng)域有待澄清和證明。針對目前RNAi的研究現(xiàn)狀，應(yīng)對其轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模商品化種植后可能出現(xiàn)的生態(tài)風險進行長期的系統(tǒng)監(jiān)測, 同時加強對作物生物安全的試驗技能研究，發(fā)展快速、準確檢測RNAi作物生態(tài)風險的新技術(shù)和新方法, 建立完善的生態(tài)安全評價體系，從而充分發(fā)揮RNAi技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的作用。