何 健,劉 娥,李小娟,陸澤焱,廖祖華,戴金玉,高益槐
[安發(fā)(福建)生物科技有限公司,福建省天然生物活性物質(zhì)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 寧德 352100]
本文研究對象為頭足類海洋生物(魷魚、烏賊、章魚等)的墨囊中的黑色素,屬于一種典型的以5,6-二羥基吲哚(DHI)和5,6-二羥基吲哚酸(DHICA)為前體的真黑色素[1]。此黑色素來源于頭足類動物的墨汁中,故定名為墨黑色素。中國烏賊種類較多,東海盛產(chǎn)曼氏無針烏賊(Sepiellamaindroni),分布于浙江南部沿海及福建沿海[2]。烏賊墨囊約占個體質(zhì)量的1.3%,在產(chǎn)品加工過程中其大多被作為廢棄物,這不僅是對資源的浪費(fèi),而且對環(huán)境水質(zhì)造成破壞。黃偉卿等[3]對曼氏無針烏賊墨的營養(yǎng)成分分析發(fā)現(xiàn),粗蛋白、粗脂肪和粗多糖分別占11.82%、1.53%和1.56%,還含有氨基酸、無機(jī)鹽等豐富的營養(yǎng)成分。試驗(yàn)研究表明,墨黑色素具有光保護(hù)、清除自由基、抗氧化、抗腫瘤等生物活性[4-8]。
目前黑色素的制備方法主要有酸水解法、堿水解法、水洗法、高速離心法及酶解法,其中酸解、堿解的反應(yīng)劇烈,對墨黑色素的結(jié)構(gòu)和活性破壞大;水洗、高速離心只能去除水溶性組分,墨黑色素純度不高,水溶性差[9];酶解法由于反應(yīng)條件溫和,對墨黑色素生物活性物質(zhì)破壞較小,能有效分離與墨黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì),同時隨著近年來酶制劑的迅猛發(fā)展,因此其在工業(yè)中得到更廣泛的應(yīng)用[10]。而超聲處理可對黑色素的物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞,電鏡結(jié)果顯示黑色素微球顆粒在超聲處理后形成了更細(xì)小的碎片和碎末[11],會更有利于酶解反應(yīng)充分快速進(jìn)行。因此,本試驗(yàn)以烏賊墨粉的水解度為考察指標(biāo),采用超聲波輔助蛋白酶水解烏賊墨粉,篩選水解效果好的蛋白酶,同時通過單因素和正交試驗(yàn)對水解條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最適反應(yīng)pH、加酶量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、固液比,并對制得的水解后墨黑色素進(jìn)行2,3,5-三羧酸吡咯(Pyrrole-2,3,5-tricarboxylic acid,PTCA)含量測定和總抗氧化能力研究,以對此超聲波輔助蛋白酶水解制備墨黑色素方法進(jìn)行評價。對烏賊墨黑色素的制備工藝進(jìn)行研究,不僅能為海洋生物活性物質(zhì)開發(fā)開拓新來源,更能促進(jìn)我國漁業(yè)水產(chǎn)品加工高值化利用的發(fā)展,具有重大的經(jīng)濟(jì)價值和社會意義。
曼氏無針烏賊墨囊,寧德市南海水產(chǎn)有限公司;木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶(食品級),南寧龐博生物科技有限公司;甲酸、甲醇為色譜純;其他試劑為分析純。
雷磁pHs-3c型pH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;
SCIENTZ-30ND型冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;
KQ-700DE型超聲波清洗器,昆山超聲儀器有限公司;
LG-21M冷凍離心機(jī),四川蜀科儀器有限公司;
TU-1810型紫外可見分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;
E3100高效液相色譜儀,大連依利特分析儀器有限公司。
1.3.1 墨粉的制備
烏賊墨囊室溫解凍后,去除墨囊表皮膜,置于托盤中,逐級真空冷凍干燥72 h,制得干燥墨粉,密封保存?zhèn)溆谩8稍锏哪勰鼙WC試驗(yàn)原料的穩(wěn)定性和均一性,有利于后續(xù)試驗(yàn)的開展。
1.3.2 蛋白酶的篩選
分別選用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶在相同蛋白酶量、水解時間1 h以及相應(yīng)合適的pH、溫度下超聲波輔助水解墨粉。水解后加熱至90℃保持5 min,使酶失去活性,8 000 r/min離心10 min,取上清液測定水解度。
1.3.3 水解度測定
采用甲醛電位滴定法測定水解后游離氨基酸總氮量,采用自動凱氏定氮法測定墨粉中總氮量,計算蛋白酶對烏賊墨粉的水解度。
水解度/%=水解后游離氨基酸總氮量/原料總氮量×100%
水解度越大,表示蛋白酶對墨粉中蛋白質(zhì)水解程度越高,即更有利于墨黑色素的純化制備。
1.3.4 酶解條件單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)
選擇最適的蛋白酶,以水解度為考察指標(biāo),進(jìn)行酶解反應(yīng)pH值、溫度、時間、加酶量、固液比的單因素試驗(yàn),并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行五因素四水平L16正交試驗(yàn),確定墨粉水解的最佳酶解條件。正交試驗(yàn)因素水平表見表1。
表1 正交試驗(yàn)因素水平表
1.3.5 水解后墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量測定
在堿性過氧化氫條件下,墨黑色素中的DHICA被氧化為PTCA,通過HPLC法測定處理后墨黑色素中氧化產(chǎn)物PTCA含量。
標(biāo)準(zhǔn)品為Toronto Research Chemicals公司生產(chǎn)的PTCA。精密稱取PTCA標(biāo)準(zhǔn)品,用0.1%甲酸配制母液,并稀釋為梯度濃度溶液,以分析物峰面積(A)對分析物濃度(C)作線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程A=168.38C-78.96,R2=0.999 9。
供試樣品的氧化處理:稱取墨黑色素樣品10 mg,添加950 μL 1 mol/L K2CO3和50 μL 30%H2O2,加熱到90℃ 90 min,流水冷卻后,加入100 μL 10%Na2SO3終止反應(yīng),加入6 mol/L HCl調(diào)pH值至2.6左右。在12 000 r/min離心10 min,過0.45 μm濾膜,注入HPLC分析測定。
色譜條件為色譜柱:E2720002(250 nm×4.6 nm,5 μm);流動相:1%甲酸(A)-甲醇(B);檢測波長:270 nm,進(jìn)樣量:20 μL,流速:0.5 mL/min[12]。
1.3.6 水解后墨黑色素總抗氧化能力測定
總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒用于測定對象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。作用原理:在酸性環(huán)境下,物質(zhì)還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反映了其總抗氧化能力。
總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,具體試驗(yàn)方法依照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
在相同蛋白酶量、水解時間及相應(yīng)合適的pH、溫度下水解墨粉,比較不同蛋白酶對墨黑色素水解度大小,結(jié)果見表2。
表2 不同蛋白酶水解墨粉水解度的比較
通過蛋白酶的水解作用,將墨粉中與墨黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)水解為可溶解的游離氨基酸,可獲得更高純度的墨黑色素。試驗(yàn)結(jié)果表明,在pH 3.0、溫度45℃條件下超聲波輔助酸性蛋白酶水解墨粉的水解度最高(6.44%)。與其他蛋白酶比較,在相同的酶解反應(yīng)時間下,酸性蛋白酶水解墨粉的水解度最高,故選用酸性蛋白酶進(jìn)行水解條件優(yōu)化。
依據(jù)酸性蛋白酶的特性和工藝條件,設(shè)計單因素試驗(yàn),分別考察酶解反應(yīng)pH值、溫度、時間、加酶量、固液比對蛋白酶水解墨粉的影響,試驗(yàn)結(jié)果如圖1。
圖1a表明,反應(yīng)pH在2.0~3.5時墨粉水解度較高;反應(yīng)pH大于3.5時,墨粉水解度顯著下降,這與酸性蛋白酶活性下降有關(guān)。圖1b結(jié)果顯示,溫度過高或過低均不利于墨粉水解,在45℃時測得墨粉水解度最高。由圖1c可知,在反應(yīng)進(jìn)行0~2 h內(nèi),水解度隨反應(yīng)時間延長而增大,而在2 h后水解度隨反應(yīng)時間延長而降低,這是因?yàn)槊复俜磻?yīng)需要足夠的反應(yīng)時間,而當(dāng)達(dá)到足夠的酶解反應(yīng)時間后,溶液達(dá)到飽和,所以水解度不再增加。圖1d結(jié)果顯示,當(dāng)酸性蛋白酶添加量低于2%時,墨粉水解度隨加酶量的增加快速增大,當(dāng)加酶量大于2%時,水解度出現(xiàn)少量下降,這是因?yàn)榉磻?yīng)pH值、溫度、時間、固液比均固定時,加大酶量即增加蛋白質(zhì)被酶切的概率,但當(dāng)加酶量達(dá)到一定量后,而反應(yīng)底物并未增加,所以水解度不會再因增加蛋白酶的量而繼續(xù)增大。圖1e表明,固液比過高或過低均不利于墨粉水解,當(dāng)固液比為1∶15時測得水解度最高,這是由于墨粉比例過大,使得墨粉分布不均勻,降低酶解效率,而溶液比例過大,會影響超聲波效率,使得水解度降低。單因素試驗(yàn)結(jié)果分析表明酸性蛋白酶水解墨粉最適反應(yīng)pH為3.0,最適反應(yīng)溫度為45℃,最佳反應(yīng)時間為2 h,最佳加酶量2%,最佳固液比1∶15。
在酸性蛋白酶水解墨粉的單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行五因素四水平L16(45)正交試驗(yàn),優(yōu)化墨粉水解的酶解條件,試驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3 酸性蛋白酶水解墨粉L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果
表3極差R值反映出對墨粉水解度影響最大的條件是反應(yīng)pH,水解最佳條件為A4B3C3D4E2,即酶解溫度50℃、水解時間2 h、加酶量3.0%,反應(yīng)pH 3.5,料液比1∶15。在此最優(yōu)條件下對墨粉進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證水解試驗(yàn),測得水解度為11.45%,高于正交試驗(yàn)結(jié)果的最高值9.77%,說明經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的水解條件是合理的。并以此最佳酶解條件對墨粉進(jìn)行水解,8 000 r/min離心10 min,棄去上清液,進(jìn)行冷凍干燥,制得水解后墨黑色素。
按照1.3.4中色譜條件測定供試品溶液和PTCA對照品溶液,分離情況如圖2和圖3所示。分析計算其峰面積,換算PTCA含量為17.621 μg/mg。高翔等[13]通過高速離心法制備得到魷魚墨黑色素,測定其墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量為9.479 μg/mg。雖然本文采用超聲波輔助酶解法有效水解了墨黑色素蛋白質(zhì),使墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量得到提高,但不同頭足類動物墨汁中墨黑色素含量的比較還未有文獻(xiàn)資料報道,不能確定不同原料對PTCA含量的影響,還需進(jìn)一步試驗(yàn)分析。
以Fe2+終濃度A吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=16.633x-0.001 7(R2=0.999 7)。通過將樣品測定吸光值帶入方程求得x(μmol/mL)。
活力單位定義:樣品的抗氧化能力以達(dá)到同樣吸光度變化值所需的標(biāo)準(zhǔn)液離子Fe2+濃度表示。
水解前后總抗氧化能力測定見表4,烏賊墨粉經(jīng)過超聲波輔助蛋白酶水解,冷凍干燥制得水解后墨黑色素的抗氧化能力為18.9 U/g,此方法保持了樣品99%的抗氧化能力。故超聲波輔助蛋白酶可有效水解墨粉,同時能保留其抗氧化能力。
在超聲波輔助酶水解烏賊墨粉的試驗(yàn)中,酸性蛋白酶具有強(qiáng)于木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶的水解能力。通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到酸性蛋白酶酶解烏賊墨粉的最佳條件為水解溫度50℃、時間2 h、加酶量3.0%,反應(yīng)pH 3.5,料液比1∶15,在此最優(yōu)條件下對墨粉進(jìn)行水解試驗(yàn),測得水解度為11.45%。HPLC測定水解后墨黑色素氧化產(chǎn)物PTCA含量為17.621 μg/mg,水解后墨黑色素總抗氧化能力(T-AOC)為18.9 U/g,總抗氧化能力保持率為99%。