白葉1號(hào)白化過程中葉綠體蛋白質(zhì)組差異分析

李勤，程曉梅，李永迪，楊培迪，黃建安,3*，劉仲華*

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白葉1號(hào)白化過程中葉綠體蛋白質(zhì)組差異分析

李勤1,2,3，程曉梅1，李永迪1，楊培迪4，黃建安1,3*，劉仲華1,2,3*

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)/茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；4. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410128

白葉1號(hào)是一種溫度敏感型白化茶樹品種，葉綠體的變化是其產(chǎn)生階段性白化現(xiàn)象的關(guān)鍵因素。本研究以白葉1號(hào)鮮葉葉綠體為研究對(duì)象，采用雙向電泳、質(zhì)譜鑒定結(jié)合生物信息學(xué)分析，研究階段性白化過程中葉綠體蛋白的表達(dá)差異，探討白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象的分子機(jī)制。結(jié)果表明，在白葉1號(hào)白化前期、白化期和復(fù)綠期葉綠體中分別識(shí)別726、748、718個(gè)蛋白質(zhì)，其中差異表達(dá)的蛋白59個(gè)，質(zhì)譜成功鑒定22個(gè)差異表達(dá)蛋白。生物信息學(xué)分析表明，差異表達(dá)蛋白直接或間接參與了光合作用、應(yīng)激響應(yīng)、核酸代謝、物質(zhì)代謝和未知功能等，其中與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)蛋白最多，占31.82%，表明階段性白化現(xiàn)象可能與這些生理功能相關(guān)。通過熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白的基因表達(dá)與蛋白表達(dá)存在一定差異，這可能是由于蛋白質(zhì)翻譯后加工及修飾造成的。上述研究為進(jìn)一步揭示白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象產(chǎn)生的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

白葉1號(hào)；階段性白化；葉綠體蛋白質(zhì)組；雙向電泳

白葉1號(hào)是一種低溫敏感型白化茶樹品種，因其新梢階段性白化現(xiàn)象和白化期較高的氨基酸含量而備受關(guān)注。多年田間觀察發(fā)現(xiàn)，白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象與新梢萌芽期溫度密切相關(guān)[1]。白化期間，其一芽二葉氨基酸含量比普通綠茶品種高1倍，茶多酚含量?jī)H為普通綠茶品種的1/2[2]。研究表明，白葉1號(hào)葉色突變和高氨基酸含量的形成機(jī)制非常復(fù)雜，受溫度、光照等外界環(huán)境因素和基因、蛋白變化等內(nèi)在因素的共同影響[3-5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，白葉1號(hào)階段性白化過程中，葉綠體內(nèi)囊體片層膜結(jié)構(gòu)被破壞、葉綠素生物合成受阻、質(zhì)體發(fā)育停滯，導(dǎo)致白化現(xiàn)象的產(chǎn)生。因此，我們推測(cè)葉綠體的變化是白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象的關(guān)鍵因素[6]。葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要細(xì)胞器，同時(shí)也是植物進(jìn)行多種生理代謝所必需的場(chǎng)所。植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離技術(shù)快速發(fā)展，亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)已成為植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個(gè)新熱點(diǎn)[7]。張立明等[8]比較了不同茶樹葉綠體分離及葉綠體蛋白質(zhì)的提取方法，并采用雙向電泳技術(shù)分離了約350個(gè)茶樹葉綠體蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)葉綠體蛋白質(zhì)點(diǎn)主要集中于等電點(diǎn)3~5之間。但目前關(guān)于白葉1號(hào)階段性白化過程中葉綠體蛋白質(zhì)組的變化尚未見報(bào)道，阻礙了白葉1號(hào)白化現(xiàn)象的分子機(jī)制研究。

本研究以白葉1號(hào)階段性白化過程中不同階段鮮葉葉綠體為研究對(duì)象，采用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究階段性白化過程中葉綠體蛋白質(zhì)組的變化，為白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象形成的分子機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白葉1號(hào)階段性白化期間樣品取自湖南省茶葉研究所高橋試驗(yàn)基地茶園。根據(jù)葉片顏色變化，采集階段性白化過程中3個(gè)典型階段葉片，包括白化前期、白化期和復(fù)綠期。取帶葉枝條插入水中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行后續(xù)樣品處理。

1.2 方法

1.2.1 葉綠體制備

葉綠體粗提物[9]：取25.0?g茶樹鮮葉，然后加入200?mL預(yù)冷的葉綠體提取液（330?mmoL·L-1L-山梨醇，50?mmoL·L-1HEPES，2?mmoL·L-1EDTANa2，1?mmoL·L-1MgCl2，1?mmoL·L-1MnCl2，0.5?g·L-1牛血清白蛋白，0.05%-巰基乙醇，pH 8.0），于預(yù)冷的勻漿杯中低速勻漿3次，每次10?s；4層紗布過濾，濾液于4℃，500×條件下，離心10?min，棄沉淀；取上清液于4℃，2?000×條件下，離心10?min，棄上清；沉淀重懸于預(yù)冷的葉綠體提取液中，于4℃，2?000×條件下，離心10?min，棄上清；沉淀重懸于3?mL預(yù)冷的葉綠體洗滌緩沖液（330?mmoL·L-1L-山梨醇，50?mmoL·L-1HEPES，2?mmoL·L-1EDTANa2，1?mmoL·L-1MgCl2，1?mmoL·L-1MnCl2，0.05%-巰基乙醇，pH 8.0），即得葉綠體粗提液。

葉綠體純化[10]：取3?mL葉綠體粗體液平鋪于Percoll密度梯度液（3?mL 80% Percoll，3?mL 40% Percoll）上層，4℃，18?000×，離心60?min，用注射器吸取40%和80% Percoll密度梯度液之間的綠色條帶至干凈的離心管中，重懸于葉綠體洗滌緩沖液，4℃，12?000×離心10?min，沉淀即為純化的完整葉綠體。

（3）葉綠體完整性與純度檢測(cè)：葉綠體完整性采用希爾反應(yīng)法檢測(cè)[11]；葉綠體純度采用過氧化氫酶活性和延胡索酸酶活性檢測(cè)法測(cè)定[12]。

1.2.2 葉綠體蛋白質(zhì)樣品制備

采用三氯乙酸丙酮沉淀法[13]，將純化的葉綠體與10%的三氯乙酸丙酮溶液按1∶15（∶）渦旋混勻，–20℃放置至少4?h，沉淀蛋白；放置后將混合液在4℃，12?000×條件下離心10?min，棄上清液，向沉淀中加入1?mL預(yù)冷的100%丙酮（含0.07%的-巰基乙醇）渦旋混勻后繼續(xù)離心10?min，至少重復(fù)洗滌沉淀3次；棄上清液，向沉淀中加入1?mL 80%預(yù)冷的丙酮（含0.07%的-巰基乙醇），混勻后離心，條件為4℃，12?000×，10?min，至少重復(fù)3次，洗至上清無色透明為止；棄去上清液，將打開管口的離心管置于冰上揮發(fā)丙酮，稱重，所得沉淀即為葉綠體中的蛋白質(zhì)，–20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

將冷凍的蛋白沉淀按1∶15（∶）加入蛋白質(zhì)裂解液，充分混勻后按體積比1∶50加入蛋白抑制劑，渦旋混勻置于冰上靜置2?h，每半小時(shí)震蕩混勻1次，之后超聲破碎6次，總共1?min（超聲5?s，停5?s），讓蛋白質(zhì)充分溶解，4℃，12?000×離心15?min，用移液槍吸取上清液到新的離心管中，即為葉綠體蛋白質(zhì)樣品，置于–20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙向電泳及質(zhì)譜鑒定

參考Li等[6]的方法，采用17?cm，pH 4~7的IPG預(yù)制膠條，上樣量350?μg，上樣體積400?μL，50?V主動(dòng)水化12?h。等電聚焦（IEF）條件：250?V緩慢升壓1?h，500?V緩慢升壓1?h，1?000?V緩慢升壓3?h，10?000?V線性升壓5?h，10?000?V快速升壓至6?h，500?V保存。聚焦后IPG預(yù)制膠條經(jīng)2次平衡，12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。Blue silver膠體考染[12]，圖像掃描，利用Bio-Rad公司PDquest軟件對(duì)凝膠進(jìn)行圖像分析。每組樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。參考Li等[6]的方法，將差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)膠內(nèi)酶解、酶解肽段抽提、ZipTip脫鹽、真空濃縮、質(zhì)譜檢測(cè)、數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定。

1.2.4 熒光定量PCR分析

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 白葉1號(hào)葉綠體制備

采用Percoll密度梯度離心法對(duì)葉綠體進(jìn)行分離純化，梯度介質(zhì)中從上至下形成兩條綠色條帶，純化的完整葉綠體主要聚集在40%與80% Percoll分離介質(zhì)梯度之間（圖1，第二條綠色條帶）。如表2所示，經(jīng)Percoll密度梯度離心法純化后，葉綠體得率為每100?g鮮葉可獲得(8.31±0.03)?mg葉綠體，葉綠體完整率為(73.68±0.54)%；線粒體和微粒體標(biāo)志酶活性檢測(cè)表明（圖2），單位時(shí)間內(nèi)純化的葉綠體提取液過氧化氫酶和延胡索酸酶活性無顯著性變化（＞0.05），表明純化的葉綠體提取液中無線粒體和微粒體污染，適合下一步試驗(yàn)要求。

2.2 葉綠體蛋白質(zhì)組雙向電泳

采用pH為4~7的IPG預(yù)制膠條和12%的SDS-PAGE膠對(duì)白葉1號(hào)白化前期、白化期及復(fù)綠期葉綠體蛋白質(zhì)組樣品進(jìn)行雙向電泳分離，染色后經(jīng)PDQuest軟件識(shí)別白化前期蛋白點(diǎn)726個(gè)，白化期748個(gè)，復(fù)綠期718個(gè)，其中豐度表達(dá)變化在1.5倍以上且Student’s-test檢驗(yàn)差異顯著（<0.05）、重復(fù)性好的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)共計(jì)59個(gè)（圖3）。差異蛋白質(zhì)分為4種表達(dá)類型：類型Ⅰ：在白化期下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，共計(jì)39個(gè)，占總差異蛋白66.10%，其中7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在白化期未表達(dá)；類型Ⅱ：在白化期上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，共計(jì)15個(gè)，占總差異蛋白25.42%，其中13個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅在白化期表達(dá)；類型Ⅲ：在白化前期、白化期和復(fù)綠期連續(xù)上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，共計(jì)3個(gè)，占總差異蛋白5.08%；類型Ⅳ：在白化前期、白化期和復(fù)綠期連續(xù)下調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，共計(jì)2個(gè)，占總差異蛋白3.39%。

圖1 葉綠體密度梯度離心

表2 葉綠體得率、完整性及純度

注：圖中數(shù)字表示差異蛋白質(zhì)點(diǎn)編號(hào)，A：白化前期，B：白化期，C：復(fù)綠期

Note: The numbers represent the different proteins. A: Pre-albinistic stage, B: Albinistic stage, C: Regreening stage

圖3 白葉1號(hào)階段性返白過程中葉綠體蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜

Fig. 3 Two-dimensional electrophoresis gel of separated chloroplast proteins in Baiye 1 during periodic albinism

2.3 差異蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定及生物信息學(xué)分析

從上文所述的4種表達(dá)模式差異蛋白質(zhì)中，選取25個(gè)不同分子質(zhì)量、不同等電點(diǎn)、分離效果好、重復(fù)性好，且差異表達(dá)豐度大于1.5倍的差異蛋白點(diǎn)。經(jīng)脫色、酶解、抽提和脫鹽后，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，成功鑒定22個(gè)差異蛋白點(diǎn)，鑒定成功率為88.00%（表3）。根據(jù)差異蛋白質(zhì)的功能，可將它們分為5類，分別為：與光合作用相關(guān)7個(gè)，占31.82%，白化期均呈現(xiàn)顯著的下調(diào)表達(dá)，復(fù)綠期表達(dá)量又逐漸恢復(fù)；與應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)5個(gè)，占22.73%；與核酸代謝相關(guān)3個(gè)，占13.64%；與物質(zhì)代謝相關(guān)4個(gè)，占18.18%；未知功能的蛋白質(zhì)3個(gè)，占13.64%。

2.4 熒光定量PCR驗(yàn)證

從鑒定到的與光合作用、核酸代謝和應(yīng)激響應(yīng)功能相關(guān)的差異蛋白中挑選5個(gè)差異蛋白質(zhì)對(duì)其基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明（圖4），熱激蛋白70、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基、-腺苷甲硫氨酸合成酶和ATP合成酶CF1亞基基因表達(dá)情況與蛋白質(zhì)表達(dá)情況一致。但真核起始因子5A4基因表達(dá)情況與蛋白質(zhì)表達(dá)情況有一定差異；與白化期相比，真核起始因子5A4在白化前期基因水平為上調(diào)表達(dá)，而蛋白質(zhì)水平為下調(diào)表達(dá)。蛋白質(zhì)和基因表達(dá)的差異可能是由于蛋白質(zhì)翻譯的可變剪切，磷酸化和糖基化等翻譯后修飾造成。

3 討論

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的一個(gè)重要細(xì)胞器。目前，對(duì)于葉綠體蛋白組學(xué)的研究主要分為葉綠體整體的蛋白質(zhì)組學(xué)和葉綠體內(nèi)不同組成部分的蛋白質(zhì)組學(xué)，如葉綠體膜蛋白組學(xué)、葉綠體基質(zhì)蛋白組學(xué)和葉綠體類囊體蛋白組學(xué)[15]。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)，研究了白葉1號(hào)階段性白化過程中葉綠體蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，并對(duì)差異蛋白質(zhì)鑒定及功能分析。

3.1 光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)

白葉1號(hào)階段性白化過程中7個(gè)與光合作用相關(guān)的蛋白差異表達(dá)，其作用涉及光呼吸、光合磷酸化、光合電子傳遞等過程。核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是植物卡爾文循環(huán)（C3循環(huán)）和光呼吸的關(guān)鍵酶[16]，由8個(gè)大亞基（分子量為56?kD）和8個(gè)小亞基（分子量為14?kD）組成，葉綠體中Rubisco是在類囊體膜上合成的。Rubisco在C3循環(huán)中能夠催化CO2與1,5-二磷酸核酮糖反應(yīng)生成2分子3-磷酸甘油酸；在光呼吸中Rubisco可以催化O2與1,5-二磷酸核酮糖反應(yīng)生成1分子3-磷酸甘油酸和1分子磷酸乙醇酸[16]。白葉1號(hào)階段性白化過程中鑒定到2個(gè)差異表達(dá)的Rubisco大亞基蛋白質(zhì)點(diǎn)（Spot 26，Spot 45），在白化期間發(fā)生了下調(diào)表達(dá)。有研究報(bào)道，在小麥白化階段葉片蛋白質(zhì)組分和含量顯著降低，其中以Rubisco亞基的降低幅度最大[17]。翁曉燕等[18]在白化水稻突變體階段性白化過程中發(fā)現(xiàn)，白化苗類囊體片層結(jié)構(gòu)缺乏，Rubisco含量顯著降低；隨葉片轉(zhuǎn)綠，類囊體片層結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)并增多，Rubisco含量也隨之顯著增加，推測(cè)白化期間Rubisco含量顯著降低與葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)缺失有關(guān)。我們前期研究也表明，白葉1號(hào)在白化期間葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)被破壞[6]。因此，白化期間葉綠體Rubisco含量顯著降低可能與類囊體膜片層結(jié)構(gòu)缺失，導(dǎo)致Rubisco合成受阻有關(guān)。能量傳遞是光合作用的重要組成部分，而ATP合成酶是能量代謝的關(guān)鍵酶，其參與光合作用中的光合磷酸化及氧化磷酸化過程，將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[19]。葉綠體中的ATP合酶位于類囊體膜上，由CF0和CF1兩部分組成[20]。白葉1號(hào)階段性白化過程中，ATP合酶（Spot 32，Spot 38，Spot 42）表達(dá)量隨著葉片的白化而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)葉片顏色逐漸復(fù)綠，該酶的表達(dá)量逐漸增強(qiáng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，葉綠體類囊體膜上若除去CF1的亞基，ATP合酶將失去催化ATP合成的能力，當(dāng)添加外源亞基，ATP合成能力就可得到恢復(fù)[21]。毛娟等[22]研究也表明，植物ATP合成酶的缺失會(huì)導(dǎo)致植物葉色黃化，光合電子傳遞受到影響。因此，推測(cè)白葉1號(hào)階段性白化過程中，由于葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)破壞，影響了ATP合酶組裝，導(dǎo)致葉色出現(xiàn)白化，ATP合成受阻；同時(shí)，C3受到抑制，使凈光合速率下降；后期隨著葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，ATP合成酶組裝隨之恢復(fù)，光合速率逐漸增強(qiáng)。細(xì)胞色素b5是生物體內(nèi)氧化反應(yīng)的電子傳遞組分，還能夠促進(jìn)膜的合成[23]。本研究中，細(xì)胞色素b5（Spot 27，Spot 39）在白葉1號(hào)白化期表達(dá)量降低，影響電子傳遞，阻礙了白化期葉片光合作用。

注：Spot 14：熱激蛋白70，Spot 26：核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亞基，Spot 28：真核起始因子5A4，Spot 34：S-腺苷甲硫氨酸合成酶，Spot 38：ATP合成酶CF1β亞基。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

表3 葉綠體差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3.2 核酸代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

葉綠體是含有自身遺傳物質(zhì)的一類細(xì)胞器，其基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。白葉1號(hào)階段性白化期間3個(gè)差異表達(dá)蛋白與核酸代謝及調(diào)控相關(guān)。葉綠體RNA結(jié)合蛋白（Spot 54）定位于葉綠體，與葉綠體基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控密切相關(guān)，它與細(xì)胞核的RNA結(jié)合蛋白具有相似的功能，包括維持RNA穩(wěn)定、RNA翻譯后調(diào)控等過程[24]。白葉1號(hào)階段性白化期間，RNA結(jié)合蛋白表達(dá)量在白化期顯著降低，隨著葉片逐漸轉(zhuǎn)綠其表達(dá)量又呈上升狀態(tài)，推測(cè)可能與白化期葉綠體發(fā)育停滯有關(guān)。有報(bào)道指出，葉綠體RNA結(jié)合蛋白與葉綠體中核糖體復(fù)合體的裝配及葉片的發(fā)育關(guān)系密切[25]，葉綠體RNA結(jié)合蛋白表達(dá)水平能對(duì)光合作用產(chǎn)生調(diào)控作用，且葉綠體中mRNAs的穩(wěn)定性會(huì)因葉綠體發(fā)育的變化而變化[26]。我們前期研究表明，白葉1號(hào)白化期葉片光合速率顯著降低，可能也與白化期RNA結(jié)合蛋白表達(dá)量降低抑制了葉綠體核糖體組裝有關(guān)[27]。真核起始因子（eIF）在真核生物翻譯過程中具有RNA解旋酶的作用。白葉1號(hào)階段性白化期間，eIF（Spot 23，Spot 28）表達(dá)量在白化期顯著降低可能與白化期葉綠體基因翻譯減少，蛋白質(zhì)合成受到抑制有關(guān)。

3.3 應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)

植物在遭受逆境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激響應(yīng)，增強(qiáng)自身對(duì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)性。熱激蛋白（HSP）在逆境脅迫下大量表達(dá)，以增強(qiáng)植物的抗逆性，根據(jù)分子質(zhì)量可分為Hsp100、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40等[28]。Hsp70主要通過參與機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、折疊及組裝和協(xié)助降解變性蛋白等多種過程來維持脅迫環(huán)境下植物機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，增強(qiáng)適應(yīng)性[29]。Hsp70蛋白存在于植物葉綠體膜和基質(zhì)，有利于維持葉綠體正常結(jié)構(gòu)及葉綠體形成，是葉綠體發(fā)育的必要條件。白葉1號(hào)階段性白化期間，Hsp70（Spot 14）表達(dá)量在白化期顯著降低，復(fù)綠期逐漸升高，可能與白化期間葉綠體發(fā)育停滯，復(fù)綠期間葉綠體重新形成有關(guān)，在白化小麥突變株中也獲得相同結(jié)果[30]。

S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）合成，SAM是合成乙烯和多胺的甲基供體。乙烯和多胺都參與了植物的抗逆反應(yīng)，因而SAMS在植物抗逆中可能發(fā)揮一定的作用。本研究中，白葉1號(hào)白化期，SAMS（Spot 34）表達(dá)量顯著提高，可能是因白化期間葉綠體被破壞，茶樹產(chǎn)生了抗逆反應(yīng)所致。

H2O2是葉綠體中光合電子傳遞和酶學(xué)反應(yīng)的重要活性氧，但過量的H2O2會(huì)引起細(xì)胞損傷，因此應(yīng)及時(shí)清除H2O2，維持葉綠體正常的光合作用。逆境環(huán)境下植物會(huì)產(chǎn)生過量的活性氧，損傷植物細(xì)胞。抗壞血酸過氧化物酶（APX）是植物體內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶，可分為葉綠體基質(zhì)APX（sAPX）、類囊體APX（tAPX）、微體APX（mbAPX）和胞質(zhì)APX（cAPX）[31]。有研究報(bào)道，菠菜完整葉綠體基質(zhì)中含有一種以光化還原劑為電子供體的過氧化物酶，即APX，但在不完整的葉綠體中APX活性很低[32]。也有報(bào)道，抗壞血酸過氧化物酶存在于白化突變苗中，而在綠苗中缺失[33]，上述結(jié)果可能是由于不同植物中APX對(duì)各種環(huán)境因素的敏感性不一致而造成的[31]。在白葉1號(hào)白化期，APX（Spot 20）表達(dá)量的降低推測(cè)是由于葉綠體發(fā)育停滯、成熟葉綠體結(jié)構(gòu)不完整導(dǎo)致APX表達(dá)量降低，隨著復(fù)綠期葉綠體結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，APX表達(dá)量也有所提高。

植物光合作用時(shí)，葉綠體中蛋白質(zhì)常受到各種損傷而喪失功能，葉綠體中分子伴侶蛋白負(fù)責(zé)受損蛋白的重新折疊，蛋白酶負(fù)責(zé)清除不能修復(fù)的蛋白，蛋白酶對(duì)葉綠體的發(fā)育及結(jié)構(gòu)維持具有重要作用[34]。ATP依賴型Clp蛋白酶主要位于葉綠體基質(zhì)，能降解多種基質(zhì)蛋白，在葉綠體發(fā)育過程中起著重要作用。Sjogren等[35]報(bào)道，抑制擬南芥ClpP6表達(dá)后，幼葉呈黃化表型，其底物主要是調(diào)控蛋白質(zhì)合成、折疊等功能的基質(zhì)蛋白。白葉1號(hào)白化期間，ATP依賴型Clp蛋白酶（Spot 22）表達(dá)在白化期有一定程度的上升，進(jìn)入復(fù)綠階段進(jìn)一步顯著上升。推測(cè)由于白化期，葉綠體結(jié)構(gòu)破壞，產(chǎn)生功能大量變性蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)ATP依賴型Clp蛋白酶表達(dá)，但由于葉綠體發(fā)育停滯僅有少量葉綠體存在，因而ATP依賴型Clp蛋白酶表達(dá)量提高有限；隨著葉片逐漸復(fù)綠，葉綠體結(jié)構(gòu)和發(fā)育恢復(fù)正常，光合作用逐漸增強(qiáng)，ATP依賴型Clp蛋白酶表達(dá)量顯著提升。

3.4 脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)

脂肪酸是植物體的重要組分，在生物膜合成、信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及能量?jī)?chǔ)存等方面具有重要作用。羥脂酰-ACP脫水酶（HAD）參與Ⅱ型脂肪酸合成代謝，主要作用是催化可逆反應(yīng)羥酰-ACP脫水生成烯酰-ACP[36]。在植物體中飽和脂肪酸合成途徑大部分發(fā)生在葉綠體中，F(xiàn)erro等[37]利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在擬南芥中鑒定到與葉綠體脂質(zhì)代謝相關(guān)的膜蛋白。白葉1號(hào)階段性白化期間，HAD（Spot 41）在白化期含量顯著降低，可能與葉綠體膜結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)，但HAD與葉片的白化是否有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

葉綠體是植物光合作用必需場(chǎng)所，白葉1號(hào)階段性白化過程中光合作用發(fā)生了顯著變化，研究白葉1號(hào)階段性白化過程中葉綠體蛋白質(zhì)組的變化，對(duì)了解和發(fā)現(xiàn)白葉1號(hào)白化期葉色突變和高氨基酸含量具有重要意義。本研究通過雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)在亞細(xì)胞和蛋白質(zhì)水平上鑒定了白化過程中部分差異表達(dá)的葉綠體蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)直接或間接參與光合作用、能量代謝、應(yīng)激響應(yīng)、脂質(zhì)代謝等生理生化過程，其中與光合作用相關(guān)的差異表達(dá)蛋白最多，表明這些生理生化過程的變化可能與白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象有關(guān)。這些結(jié)果為闡明白葉1號(hào)階段性白化現(xiàn)象的分子機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Analysis of the Chloroplast Proteome Difference of ‘Baiye 1’ [(L.) O Kuntze] during Periodic Albinism

LI Qin1,2,3, CHENG Xiaomei1, LI Yongdi1, YANG Peidi4, HUANG Jian'an1,3*, LIU Zhonghua1,2,3*

1. Tea Key Lab of the Ministry of National Teaching of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China;3. Hunan Co-Innovation Center for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China;4. Tea Research Institute, Hunan Academy of Agriculture Sciences, Changsha 410128, China

‘Baiye 1’ is a kind of temperature sensitive tea cultivar. The change of chloroplast is the key factor for the periodic albinism of ‘Baiye 1’. To understand the mechanism of periodic albinism of ‘Baiye 1’, two dimensional electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry was adopted to separate and identify the chloroplast proteins, which were significantly changed during the three developmental periods. The results show that 726, 748 and 718 protein spots were separated at the pre-albinistic, albinistic and regreen stages, respectively. The expression levels of 59 protein spots varied markedly during the three development stages. A total of 22 protein spots were successfully identified by MS, which were involved in photosynthesis, stress response, metabolism of nucleic acid, substance metabolism and unknown function. Photosynthetic proteins were the most affected proteins, which account for 31.82% in the significantly changed proteins. These results indicate that these physiological processes might playcrucial roles in the periodic albinism. The gene expression profiles of the differentially expressed proteins were alsoverified by real-time PCR analysis. The results show that the expressions of genes and proteins were not consistent, which might be related to the protein processing and post-modification. These results provide a theoretical basis for understanding the molecular mechanism of periodic albinism in ‘Baiye 1’.

Baiye 1, periodic albinism, chloroplast proteome, 2-DE

S571.1

A

1000-369X(2019)03-325-10

2018-11-05

2019-01-01

國(guó)家自然科學(xué)基金（31200522）、湖南省教育廳科研項(xiàng)目（15B116）、湖南省財(cái)政廳科技專項(xiàng)（湘財(cái)教指[2016]175號(hào)）、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年基金項(xiàng)目（15QN28）

李勤，男，講師，主要從事茶葉生物化學(xué)和種質(zhì)資源創(chuàng)新方面的研究，E-mail: liqinvip@126.com。*通信作者