楊歡 宋紅星 崔磊

[摘要] 目的 探討金黃色葡萄球菌上清液對椎間盤髓核細胞蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型膠原（COLⅡ）的影響。 方法 體外分離培養(yǎng)SD大鼠椎間盤髓核細胞，使用不同濃度（0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%）金黃色葡萄球菌上清液處理，模擬椎間隙感染病程，采用CCK-8檢測第二代髓核（P2）細胞增殖活性；采取RT-PCR檢測第二代髓核細胞的基因表達量。 結(jié)果 本研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌上清液加速髓核細胞去分化，刺激ACAN、COLⅡ表達下降（P < 0.05），上清液濃度>20%時，會明顯抑制髓核細胞外基質(zhì)合成。 結(jié)論 經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌上清液可以抑制髓核細胞生長，且具有濃度依賴性；刺激ACAN、COLⅡ表達減少可能是造成椎間隙感染后持續(xù)腰背痛的原因。

[關(guān)鍵詞] 髓核細胞；椎間隙感染；腰痛；金黃色葡萄球菌

[中圖分類號] R981.5 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）05（a）-0008-04

[Abstract] Objective To Discus on the Staphylococcus aureus supernatant of intervertebral disc nucleus pulposus cells proteoglycans （ACAN）， type Ⅱ collagen （COL Ⅱ）. Methods Cultured SD rat intervertebral disc nucleus pulposus cells were isolated in vitro and treated with Staphylococcus aureus supernatant at different concentrations （0%， 5%， 10%， 15%， 20%， 25%， 30%， 35%， 40%） to simulate the course of intervertebral space infection. CCK-8 was used to detect the proliferation activity of the second generation nucleus pulposus （P2） cells. RT-PCR was used to detect the gene expression of the second generation nucleus pulposus cells. Results This study found that the supernatant fluid of Staphylococcus aureus that accelerate nucleus pulposus cells to divide， stimulate ACAN， COL Ⅱ expression decreased （P < 0.05）， the supernatant fluid concentration > 20%， can significantly inhibit extracellular matrix synthesis of nucleus pulposus. Conclusion The results showed that Staphylococcus aureus supernatant could inhibit the growth of nucleus pulposus cells in a concentration dependent manner. Stimulate ACAN， COL Ⅱ expression decrease may be the cause of intervertebral infection after continuous low back pain.

[Key words] Nucleus pulposus； Spontaneous spondylodiscitis； Low back pain； Staphylococcus aureus

椎間隙感染（Spontaneous spondylodiscitis，SS）是一種少見但嚴重的脊柱疾病，伴有炎癥過程，椎體破壞，最終累及椎間盤[1-3]。患者住院時間30～57 d不等，發(fā)病率為0.2%～2.0%[4]。有研究[5]表明，金黃色葡萄球菌是最常見的病原菌，占這些病例的40%以上。

在成人中，SS通常由膿毒性栓子導(dǎo)致相鄰終板缺血梗死、椎體結(jié)構(gòu)破壞、壓縮性骨折為主，進而導(dǎo)致椎間盤感染[6-7]。然而，在治療椎間隙感染過程中，盡管進行了長期的抗生素和外科治療，但是患者常常出現(xiàn)明顯的腰背痛（low back pain，LBP），且其住院治療時間往往較長[8-10]。目前，金黃色葡萄球菌引起髓核感染和椎間盤炎持續(xù)性腰痛的機制尚不明確。髓核細胞一般處于低增殖、低分化狀態(tài)，損傷后往往難以修復(fù)。明顯降解髓核細胞外基質(zhì)（ECM）、聚集蛋白（ACAN）和COL2A1，這些改變都可導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)破壞和功能損害[11-13]。腰痛通常是由椎間盤退變引起的[14-15]。然而，髓核細胞退變與SS之間的關(guān)系卻報道甚少。本研究旨在通過探討金黃色葡萄球菌發(fā)酵上清液對大鼠髓核細胞去分化的影響，以及可能的腰背痛機制。

1 材料與方法

1.1 髓核的收集和培養(yǎng)

SPF級健康成年SD雌性大鼠3只，體重250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004，動物質(zhì)量合格證號：114013000 74465。無菌條件下取出脊柱，切除腰椎間盤。將凝膠狀髓核用解剖顯微鏡從纖維環(huán)分離，進一步用眼科剪剪碎，0.25%Ⅱ型膠原酶震蕩，在37℃消化4～6 h。中和后，離心和重懸于DMEM/F12（20%血清和0.02%青鏈霉素），37℃ 5%CO2的恒溫箱中孵育。培養(yǎng)基每3 d更換1次。當(dāng)細胞匯合度達90%時，進行細胞傳代。在隨后的研究中使用第二代細胞（P2）[16]。

1.2 金黃色葡萄球菌上清液處理髓核細胞

將于-20℃冰箱保存的金黃色葡萄球菌的國際標(biāo)準菌株ATCC25923取出，復(fù)溫后種植于普通肉湯培養(yǎng)基（TSB）中。以37℃為發(fā)酵溫度，搖勻培養(yǎng)20 h，3%為接種標(biāo)準。使用分光光度計（Evolution 60，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）將懸液TSB稀釋至4×107 CFU/mL。4℃ 10 000 g（r = 6.3 cm）離心15 min，其上清液用0.22 μm硝化纖維膜收集和過濾并在4℃儲存。簡言之，P2和P4髓核細胞分別用0%（DMEM/F12含10%胎牛血清和抗生素）、10%、20%和30%、40%金黃色葡萄球菌上清液處理，每3天更換1次培養(yǎng)基。

1.3 細胞增殖實驗

使用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。將髓核細胞P2以2000細胞/孔接種在96孔板中培養(yǎng)24 h，然后將培養(yǎng)基去除，以0%（DMEM/F12含10%胎牛血清和0.02%抗生素）、10%、20%、30%、40% 濃度的金黃色葡萄球菌上清液替代。最后，每孔在不同時間點加入10 μL CCK 8試劑，5% CO2 37℃中孵育1 h。在第1、3、5、7天分別用酶聯(lián)免疫吸附試驗閱讀器（Thermo Fisher Scientific）于450 nm處檢測吸光度，計算細胞存活率。至少重復(fù)3次。

1.4 RT-PCR

樣品體積約1 mL室溫放置5 min，加入0.2 mL的氯仿，劇烈搖晃15 s，室溫放置5 min，4℃，12 000 g （r = 6.3 cm）離心15 min；離心后的液體分成三層，上層是無色的水相，將上層0.5 mL轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中，加入0.5 mL異丙醇，混勻后靜置10 min，然后4℃ 12 000 g（r = 6.3 cm）離心15 min；加入0.5 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃ 7500 r/min（r = 6.3 cm）離心5 min，室溫干燥RNA沉淀5～10 min，加入無RNase水50 μL溶解RNA，用槍頭反復(fù)吹打幾次，55℃溶解10 min。RNA先用DNA酶處理，去除RNA中含有的基因組DNA，37℃孵育30 min，之后加入1 μL 終止液，然后在65℃孵育5 min，終止反應(yīng)。純化后的RNA進行cDNA模板第一鏈的合成。反轉(zhuǎn)錄第一鏈合成的反應(yīng)首先將純化后的RNA 8 μL、隨機引物 1 μL和超純水1 μL，65℃孵育5 min，迅速取出放冰上，靜置5 min。然后分別加入反轉(zhuǎn)錄緩沖體系5×Buffer 4 μL、MgCl2 3 μL、RNA酶抑制劑0.2 μL、dNTP Mix 1 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL和超純水0.8 μL。25℃孵育5 min，42℃反應(yīng)1 h，70℃ 10 min，之后結(jié)束程序。qPCR反應(yīng)條件：95℃ 2 min，95℃ 10 s、55℃ 30 s、60℃ 30 s共40個循環(huán)，熔解曲線生成2 min。引物序列見表1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較釆用q檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌上清液對髓核細胞的刺激作用

2.1.1 金黃色葡萄球菌上清液對髓核細胞的細胞毒性作用 為了確定金黃色葡萄球菌對髓核細胞的影響，加入金黃色葡萄球菌上清液的髓核細胞（P2）經(jīng)離心過濾預(yù)接種于96孔板上，分別以0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%濃度培養(yǎng)48 h。結(jié)果表明，與對照組比較，10%及以下濃度的金黃色葡萄球菌上清液對髓核細胞活力無影響，而15%的上清液亦無顯著影響，但濃度>20%，不同濃度金黃色葡萄球菌上清液可抑制髓核細胞活力（P < 0.05）。見圖1。其細胞生長情況。見圖2（封四）。

2.2 金黃色葡萄球菌上清液對髓核細胞生長的影響和刺激作用

采用RT-PCR探討了金黃色葡萄球菌上清液對髓核細胞的刺激作用。當(dāng)該上清液濃度>20%時，蛋白多糖、Ⅱ型膠原（COLⅡ）表達下調(diào)，抑制細胞合成。這些結(jié)果表明，該上清液濃度>20%，髓核細胞合成的功能被完全抑制。見圖3。

2.3 金黃色葡萄球菌上清液對髓核細胞中ACAN、COLⅡ的表達水平的影響

細胞增殖檢測的結(jié)果見圖4。髓核細胞經(jīng)10%濃度的金黃色葡萄球菌上清液處理7 d后，利用RT-PCR分別檢測髓核細胞的ACAN、COLⅡ在10%、20%金黃色葡萄球菌上清液濃度作用下3、7 d的表達量，經(jīng)處理7 d時ACAN、COLⅡ的表達量明顯低于3 d（P < 0.05）。見圖5。

3 討論

SS多由金黃色葡萄球菌由血液播散引起，目前臨床治療有激素和頭孢類抗生素的使用，以及髓核摘除、椎體融合等，但有關(guān)椎間盤炎的基礎(chǔ)研究很少[1，2，17]。

SS的癥狀以背痛最為常見（85%）[14]。LBP的病理生理原因復(fù)雜，髓核細胞退變被廣泛認為是導(dǎo)致LBP[18-19]的主要原因之一。正常的髓核細胞外基質(zhì)的合成和分解代謝平衡的。髓核細胞退變時COLⅠ、COLⅢ表達增強，髓核細胞向去分化表型轉(zhuǎn)變，ACAN和膠原（COLLA2a1）含量降低，可能導(dǎo)致腰背痛[20]。SS患者多存在明顯的持續(xù)性腰背疼痛，但是，目前尚不清楚髓核細胞是否會因感染金黃色葡萄球菌而發(fā)生退變，進而引起腰背痛。

本研究發(fā)現(xiàn)，在20%金黃色葡萄球菌上清液刺激使用下，髓核細胞ACAN、COLⅡ的表達明顯降低。COLⅡ是軟骨中主要的結(jié)構(gòu)膠原纖維網(wǎng)絡(luò)，可提供壓縮和拉伸功能強度，ACAN與膠原纖維網(wǎng)絡(luò)相互作用，使髓核細胞具有壓縮剛度[21]。因此，一旦ACAN、COLⅡ的表達減少，髓核細胞抵抗變形和壓迫的能力就會大大減弱，進而發(fā)生髓核退變，造成腰背痛。然則，對于這些標(biāo)志物在SS中的改變卻鮮有報道。

總的來說，這些結(jié)果表明，椎間盤感染后引起ACAN和COLⅡ的合成下降，這也許是椎間盤感染患者持續(xù)腰背痛的原因。

由于椎間盤細胞破壞修復(fù)能力差，且抗生素使用效果不佳，目前臨床對SS的治療干預(yù)較晚。如果在椎間盤軟骨類細胞感染早期即進行治療干預(yù)，能夠有效提高軟骨細胞存活率，減少軟骨基質(zhì)破壞，甚至可能修復(fù)再生健康軟骨[22-23]。但是，盡管早期應(yīng)用抗生素治療，也可能不能阻止椎間隙感染后椎體破壞的進程。因此，探究SS的早期病理過程，發(fā)現(xiàn)其中可介入控制的影響因素及提出早期預(yù)后判斷指標(biāo)是椎間隙感染進一步治療的關(guān)鍵。

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（收稿日期：2019-02-02 本文編輯：封 華）