范維肖，刁艷君，馬越云，郝曉柯

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院檢驗科，西安 710032)

外泌體是直徑為30～150 nm的具有脂質雙層膜結構的一種細胞外囊泡，起源于細胞內的多囊泡體(MVB)[1]，MVB通過與細胞膜融合而后將外泌體釋放到細胞外。外泌體可由多種細胞分泌并存在于諸如血液、尿液、乳汁以及膽汁等多種體液中，并且攜帶了宿主細胞來源的DNA，RNA和蛋白質等信息[2]，因此外泌體在細胞與微環(huán)境及遠隔器官之間的交流中扮演著重要的角色[3]，而體液中的外泌體可以反映疾病的狀況，許多研究都證實了外泌體攜帶的核酸、蛋白質以及脂質等都可以作為疾病診斷的標志物，因此外泌體也成為液體活檢領域重要的三大方向之一[4-6]。

雖然外泌體的功能及臨床應用已經被許多研究證實，但目前簡便高效提純外泌體的方法依然是外泌體研究的重要限速步驟，目前常用的提取方法有超速離心法、蔗糖密度梯度離心法、PEG沉淀法、磁珠法以及膜親和柱法等[7-8]，超速離心法是外泌體提取的金標準，但超速離心法耗時耗力，并且提取率低；沉淀法雖然簡單，但會同時沉淀許多雜蛋白，并且商品化試劑成本高；磁珠法適用于提取血液等起始量要求較低的生物樣本來源的外泌體，用途有限；膜親和柱法適用于提取包括細胞上清、血液及尿液等多種生物體液來源的外泌體，且操作相對簡便。基于此，本研究通過常規(guī)的外泌體鑒定方法，對比了超速離心法和QIAGEN膜親和柱法提取外泌體的特點，為外泌體的基礎和臨床研究提供方法學參考。

1材料與方法

1.1 細胞株來源 前列腺癌LNCaP-AI+F由浙江大學醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院陶志華教授饋贈；LNCaP-AI+F細胞用含10 g/dl炭處理血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在75 cm2的玻璃培養(yǎng)瓶中，待細胞生長至70%密度更換為含10 g/dl無外泌體血清的無酚紅DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞上清。

1.2 試劑和儀器 無酚紅DMEM培養(yǎng)基購自吉諾生物，炭處理FBS購自BI公司，無外泌體血清購自上海逍鵬生物；CD63抗體購自Abcam，ALIX與EGFR抗體購自CST公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司。超速離心法采用Beckman超高速離心機對細胞上清進行離心；QIAGEN膜親和柱法所用試劑和柱子由QIAGEN公司提供，采用Beckman AllegraX-15R離心機離心。

1.3 方法

1.3.1 外泌體提?。撼匐x心法：按照THERY等[9]的文獻報道，收集40 ml細胞上清，300 g離心10 min去除漂浮的細胞，棄沉淀吸取上清；2 000 g離心10 min去除死細胞，棄沉淀吸取上清；10 000 g離心30 min去除細胞碎片，棄沉淀吸取細胞上清；100 000 g離心70 min，所得沉淀為外泌體和雜蛋白；PBS清洗沉淀后繼續(xù)再次100 000 g離心70 min，棄上清，用40 μl PBS重懸沉淀即為最終提取的外泌體。

QIAGEN膜親和柱法：按照試劑盒說明書，收集40 ml細胞上清最終得到400 μl Buffer XE重懸的外泌體，而后將400μl外泌體加入100 kD超濾濃縮管12 000 r/min離心置換重懸液為PBS并濃縮外泌體至40 μl。

1.3.2 外泌體電鏡鑒定：吸取10 μl外泌體樣品滴于銅網，室溫靜置10 min；濾紙吸干銅網上的液體，滴加2 g/dl磷酸鎢染液10 μl負染，室溫靜置5 min，濾紙吸去多余的液體，白熾燈下干燥后透射電鏡下觀察拍照。

1.3.3 BCA蛋白定量與外泌體純度計算：收取LNCaP-AI+F細胞，300 g離心去除上清，100 μl細胞裂解液冰上裂解30 min，外泌體樣品無需裂解。按照BCA蛋白定量試劑盒說明書配制蛋白標準品，而后蛋白標準品與細胞裂解及兩種方法提取外泌體各取10 μl加入到96孔板，細胞裂解及外泌體設置三個復孔，加入200 μl工作液與樣品37℃反應20 min后測得吸光度，繪制標準曲線計算出細胞裂解及兩種方法提取外泌體濃度。

1.3.4 Western blot鑒定外泌體蛋白表達：根據BCA測得濃度，細胞裂解與超離及膜親和柱法提取外泌體以15 μg的總蛋白量上樣進行SDS-PAGE電泳，PVDF膜半干轉印8 min，封閉液封閉1 h，分別與一抗搖床孵育2 h后4℃冰箱過夜。第二天回收一抗，TBS洗膜三次并與對應熒光二抗孵育1 h，之后TBS洗膜三次熒光掃描儀下掃膜觀察條帶并拍照記錄。

2結果

2.1 電鏡分析 圖1A為超速離心法提取外泌體電鏡圖，圖1B為膜親和柱法所提取外泌體電鏡圖，兩種方法均可在電鏡下觀察到外泌體結構，且直徑均為100 nm左右，符合外泌體的粒徑分布范圍。超速離心法背景較為干凈，雜質較少，而膜親和柱法所得外泌體電鏡下有類似蛋白聚合物等雜質存在。

A B

2.2 Western blot鑒定外泌體蛋白表達 實驗中選取了外泌體的標志蛋白ALIX以及CD63，內參蛋白β-actin以及研究目的蛋白EGFR對兩種方法所提取的外泌體蛋白表達進行了鑒定。圖2所示，同等上樣量，超速離心法外泌體ALIX和CD63均可見條帶，而膜親和柱法外泌體ALIX可見微弱條帶，CD63無條帶。超速離心外泌體β-actin與細胞裂解基本一致，而膜親和柱法外泌體β-actin較細胞裂解弱，超速離心提取外泌體EGFR相對細胞裂解高表達，而膜親和柱法提取外泌體這種富集的趨勢并不明顯。

2.3 Zetaview粒徑分析 見圖3A所示。超速離心外泌體粒徑分布峰值為116 nm，圖3B表明QIAGEN膜親和柱法外泌體樣本粒徑分布峰值為

122 nm，兩者粒徑分布均符合外泌體粒徑分布范圍。

注：Cell lysate代表細胞裂解；Exo UC為超速離心法提取外泌體；Exo QIA為QIAGEN膜親和柱法提取外泌體

圖2兩種方法提取外泌體標志蛋白及目的蛋白鑒定

A B

2.4 外泌體電勢 外泌體電勢分析表明超速離心法提取的外泌體電勢為-23.46±2.38 mV：膜親和柱法提取外泌體電勢為-30.37±0.79 mV，較超速離心法提取外泌體電勢更為偏負，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.77，P<0.01)，兩者均符合外泌體的電勢分布范圍[10-11]。電勢越負，表明外泌體越穩(wěn)定[12]，超速離心外泌體負值偏小可能與較高的離心力會影響外泌體的穩(wěn)定性有關。

2.5 外泌體純度 外泌體顆粒數與蛋白濃度的比值是用于評價外泌體純度的一個指標，比值越高表明提取的外泌體越純[7，13]。超速離心法提取的外泌體顆粒濃度與蛋白濃度比值為(9.7±1.2)×108particles/μg，高于QIAGEN膜親和柱法的(6.5±1.4)×108particles/μg，差異有統(tǒng)計學意義(t=13.47，P<0.01)。

3討論近年來越來越多的研究都證實了外泌體在細胞間通訊中扮演著重要的角色，特別是在腫瘤的發(fā)展過程中，腫瘤細胞來源的外泌體可通過多種信號通路賦予正常細胞、基質細胞及免疫細胞等相應的適于腫瘤生長的特性[14-15]。研究報道前列腺癌細胞來源的外泌體富集SRC，IGF-1R以及GRK等多種蛋白，可以激活細胞內的多種信號通路[16-17]，并且外泌體中的miRNA分子也已經被廣泛報道可用于前列腺癌的臨床診斷[18-19]，因此外泌體在前列腺癌的發(fā)病機制及液體活檢中都具有重要的研究價值。

但在深入研究外泌體之前，如何從有限的生物樣本高效可靠地分離提取外泌體仍然是一項挑戰(zhàn)，超速離心法是目前提取的金標準，但超高速離心機繁瑣的步驟和操作及其較低的提取率一定程度上對實驗研究造成了限制，因此探索其它更快捷高效的提取方法可以為外泌體的后續(xù)內容物分析和功能研究奠定良好的基礎。RICHARD等比較了超速離心法、沉淀法、超濾法和尺寸排阻法提取細胞上清外泌體的特點，發(fā)現超濾法和尺寸排阻法提取外泌體純度與超速離心法相當，但超濾法大量濃縮細胞上清費時費力，簡便性不及超速離心法，而尺寸排阻法單次可提取樣本體積較小，不適用于需要大量外泌體的功能研究[7]；本研究通過電鏡形態(tài)比較、Western blot蛋白鑒定、Zetaview顆粒濃度、粒徑及電勢分析以及純度比較了超速離心法和QIAGEN膜親和柱法提取前列腺癌細胞上清的特點，實驗結果表明兩種方法均可提取前列腺癌細胞上清的外泌體，超速離心法提取外泌體處理步驟繁瑣，需要超速離心機，適合對外泌體純度要求嚴格的實驗，而QIAGEN膜親和柱法純度不及超速離心法，但可快速提取生物樣本來源的外泌體，適用于核酸分析等實驗。

外泌體重要的生物學功能使得對于基礎研究和臨床檢測應用都具有重要的意義，因此選擇合適的分離提取方法也成為外泌體研究的基礎，本文從多個方面對比了目前常用的超速離心法和QIAGEN膜親和柱法在提取細胞上清外泌體方面的優(yōu)缺點，希望能為外泌體內容物分析和功能實驗等相關研究提供參考和基礎。