林詩涵

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院 國家加工食品監(jiān)督檢驗中心[福州]，福建 福州 350002）

食源性致病菌，是指可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細菌。食源性致病菌約有幾十種，通常易引發(fā)食源性疾病的致病菌主要有以下7種[1,2]：致病性大腸埃希菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌。據(jù)統(tǒng)計，世界上70%的食源性疾病均由致病微生物所引發(fā)。近年來，部分畜牧業(yè)生產(chǎn)者片面追求產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，違規(guī)使用違禁藥品，給人類健康帶來危害。2017年6月22日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017-2020年）》，并提出推進獸用抗菌藥物減量化使用、優(yōu)化獸用抗菌藥物品種結(jié)構等5條行動目標[3]。而中草藥作為我國傳統(tǒng)的藥用資源，具有療效可靠、抗菌、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[4,5]，是篩選高效、安全抗菌藥物的重要來源。

白頭翁湯始載于張仲景的《傷寒論·厥陰篇》，“熱利下重者，白頭翁湯主之”，是一味經(jīng)典的熱毒下痢良方。現(xiàn)代藥效學研究表明，白頭翁湯具有抗菌、抗炎、抗?jié)?、促進免疫調(diào)節(jié)、抑制動物腸管運動、抗腹瀉、對抗內(nèi)毒素對機體的損害的功效[6]。對于細菌性痢疾[7-8]和潰瘍性結(jié)腸炎[9]有著良好的治療效果。另外，在畜牧醫(yī)學上也可用于治療動物痢疾，比如豬痢[10]和牛痢[1]。本實驗選擇鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌為對象，進行白頭翁湯劑的體外抑制試驗，旨在為后續(xù)食源性疾病的臨床用藥和研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

白頭翁、黃柏、黃連、秦皮購于福建中醫(yī)藥大學承創(chuàng)堂藥店，由福建中醫(yī)藥大學藥學院鑒定。

1.1.2 菌種

鼠傷寒沙門氏菌（CGMCC1.1174）購置于中國微生物菌種保存中心；志賀氏菌（ATCC25931）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）購置于北京陸橋責任有限公司。

上述菌種由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院微生物室鑒定并保存（菌種代數(shù)＜5代）。

1.1.3 試劑

營養(yǎng)瓊脂、胰酪胨大豆肉湯（TSB肉湯）、Mueller-Hintonation肉湯（M-H肉湯）、血平板、氯化鈉、環(huán)丙沙星和75%乙醇。

1.1.4 儀器

AF-20中藥粉碎機、索氏提取裝置、HB 10 S96旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、115043真空泵、DLIO-1000液循冷卻器、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HVE-50自動高壓滅菌器、電熱鼓風干燥箱、LRH系列37℃恒溫培養(yǎng)箱、QT-1旋渦混合器、FG101727游標卡尺、Whatman’s No.06無菌定性濾紙和6 mm打孔器，等。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備

取白頭翁15 g，黃柏12 g，黃連6 g，秦皮12 g置于中藥打粉機中粉碎至粗粉狀。將藥材粗粉放進濾紙筒內(nèi)，輕壓使其平實后將濾紙筒裝入索氏提取器，用8倍量的75%乙醇回流提取1 h，重復3次，合并提取液，減壓抽濾；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，至無醇味。將藥液濃縮至流浸膏狀（每1 mL約含原藥材1 g），作為供試藥液[11]。

1.2.2 菌液的制備

將鼠傷寒沙門氏菌的標準菌株劃線接種到血平板上，置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，挑選適宜的菌落接種到10 ml的TSB肉湯中，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)24 h。

將培養(yǎng)好的菌懸液稀釋至1麥氏濁度（細菌濃度約1×108 CFU/mL），4 ℃冷藏備用[12]。

志賀氏菌、金黃色葡萄球菌樣液依照同樣的方法制備。

1.2.3 含菌培養(yǎng)皿的制備

傾注融化并冷卻至46 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成營養(yǎng)瓊脂平板。分別取上述制備好的菌懸液稀釋至106 CFU/mL菌含量，與冷卻至46 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按1∶10的比例混合，充分混勻后取10 mL于上述制備好的營養(yǎng)瓊脂平板上，輕輕搖動平板使菌液均勻鋪平，制成含菌平板。

1.2.4 K-B紙片法[13]抑菌試驗

每個含菌平板上貼3張空白圓紙片，使3張圓紙片呈正三角形分布，且每張紙片的距離不小于32 mm，分別吸取10 μL的供試藥液、濃度為50 μg/mL的環(huán)丙沙星溶液和0.85%生理鹽水緩緩滴加在圓紙片上，使其充分吸收，每種菌做2個平行樣。

將平板置于4 ℃的冰箱中活化2 h，后轉(zhuǎn)入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)24 h。觀察并用游標卡尺測量所形成的抑菌圈的直徑大小，采用十字交叉法，測量3次，取平均值[14]。

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）測定

采用二倍稀釋法[15]測定。取10支滅菌M-H肉湯試管，編號1～10#。1～8#試管加入1 mL等比濃度的白頭翁湯劑，使1～8#小試管濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625 g/mL。取供試菌液（細菌濃度約106CFU/mL）1 mL分別加入1～9#，9#為不加供試藥液的陽性對照，10#加入供試白頭翁藥液，作為不加供試菌液的陰性對照。

將10支試管于37 ℃的恒溫培養(yǎng)24 h后取出，充分混合均勻后，用移液槍吸取100μL混合液，于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上面，均勻涂布，至液體完全吸收。放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出并觀察細菌的生長情況，無細菌生長試管清澈透明的最低藥物濃度為藥物對細菌的最小抑菌濃度（MIC），以肉眼觀察細菌被100%滅殺的濃度為藥物對細菌的最小殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果

2.1 K-B紙片法抑菌結(jié)果

白頭翁湯劑對鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用見表1。抑菌圈直徑＞20 mm 為高度敏感（+++），15～20 mm 為中度敏感（++），8～15 mm 為輕度敏感（+），＜8 mm為耐藥或無抑制活性（-）[14]。

2.2 白頭翁湯劑的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.2.1 鼠傷寒沙門氏菌的MIC和MBC結(jié)果

1#鼠傷寒沙門氏菌M-H肉湯試管肉湯澄清，2～8#試管肉湯渾濁，9#陽性對照管肉湯渾濁，10#陰性對照管肉湯澄清。對應的營養(yǎng)瓊脂平板上，1#平板無細菌生長，2#平板呈零星生長，3#平板呈分散生長，4～8#平板細菌連片生長，9#平板細菌連片生長，10#平板無細菌生長，結(jié)果見表2。白頭翁湯劑對于鼠傷寒沙門氏菌的MIC=0.125 g/mL、MBC=0.5 g/mL。

2.2.2 志賀氏菌的MIC和MBC結(jié)果

1、2 #志賀氏菌M-H肉湯試管肉湯澄清，3～8#試管肉湯渾濁，9#陽性對照管肉湯渾濁，10#陰性對照管肉湯澄清。對應的營養(yǎng)瓊脂平板上，1和2#平板無細菌生長，3#平板呈零星生長，4#平板呈分散生長，5～8#平板細菌連片生長，9#平板細菌連片生長，10#平板無細菌生長，結(jié)果見表2。白頭翁湯劑對于志賀氏菌的MIC=0.0625 g/mL、MBC=0.25 g/mL。

2.2.3 金黃色葡萄球菌的MIC和MBC結(jié)果

1、2 #金黃色葡萄球菌M-H肉湯試管肉湯澄清，2～8#試管肉湯渾濁，9#陽性對照管肉湯渾濁，10#陰性對照管肉湯澄清。對應的營養(yǎng)瓊脂平板上，1和2#平板無細菌生長，3～6#平板呈分散生長，但隨著藥液濃度的稀釋，金黃色葡萄球菌菌落數(shù)遞增， 7、8#平板上金黃色葡萄球菌連片生長，9#平板細菌連片生長，10#平板無細菌生長，結(jié)果見表2。白頭翁湯劑對于金黃色葡萄球菌的MIC=0.015625 g/mL、MBC=0.25 g/mL。

3 討論

微生物耐藥性和抗生素濫用以及不斷增加的不良反應已成為全球關注的嚴峻問題，許多新的病原微生物和耐藥菌的產(chǎn)生對人類和動物健康造成極大威脅。因此，防止微生物耐藥性產(chǎn)生和尋找特效抗菌藥物成為當務之急[16]。我國中草藥資源豐富，長期使用較少產(chǎn)生耐藥性，不易出現(xiàn)殘留、抗藥性、毒副作用，具有安全性和可靠性，是其他抗生素無可比擬的[17]。

表1 白頭翁湯劑的K-B紙片抑菌結(jié)果

表2 白頭翁湯劑對3種致病菌的MIC、MBC測定結(jié)果

本實驗以鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌為供試菌，分別來測試白頭翁湯劑的抑菌活性。從結(jié)果中可以看出，白頭翁湯劑對志賀氏菌和金黃色葡萄球菌有明顯的效果，對鼠傷寒沙門氏菌效果較好，且抑菌效果與藥湯劑濃度無特定的比例關系。這可能是由于中草藥含有多種成分，而各成分的活性強度（抗菌能力）有所不同，以及抑菌機理的不同所致。

本實驗白頭翁湯劑對挑選的3種致病菌的抗菌效果不能簡單的以藥物的MIC和MBC來評價，而忽略了機體自身免疫機能的影響。本實驗采用體外環(huán)境作為抑菌背景，而藥物的作用環(huán)境大多在機體內(nèi)部[18]，抑菌效果必然有所差異，需要后續(xù)實驗進行進一步的論證。可以預見的是，利用中草藥防治細菌性疾病，減少抗生素及化學合成藥物的使用，降低藥物殘留對人類的危害，將是發(fā)展現(xiàn)代中藥學的必然趨勢。