費(fèi)煜暢 鄭戴波 潘 磊 陳培豐#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053

2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310006

黃芪多糖（APS）作為黃芪主要的抗癌成分之一，較多研究已表明其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成等方面發(fā)揮作用，且可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫水平[1-3]?；贏PS在這些方面的研究，本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同濃度APS及不同作用時間下脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞存活率和產(chǎn)生IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)量，探討APS對THP-1源巨噬細(xì)胞免疫功能的影響，為進(jìn)一步研究黃芪多糖的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制及中藥黃芪的臨床抗癌效用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料：人單核細(xì)胞（THP-1）細(xì)胞，購自上海中科院細(xì)胞庫。黃芪多糖注射液（APS）由西安瑞盈生物科技有限公司生產(chǎn)（純度＞90%）。CCK-8（聯(lián)科公司）；佛波酯（PMA）、LPS（美國Sigma公司）；RT-PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA株式會社）；ELISA試劑盒（eBioscience公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）。超凈工作臺（Heal Force公司）；熒光化學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司）；CO2恒溫孵育箱、Thermo 3111、溫度梯度PCR儀、Biometra T-Gradient、ABI 7500 Real-Time PCR儀等（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 造模方法：將THP-1細(xì)胞接種于六孔板，密度為（1～2）×106/ml，每孔細(xì)胞中加入濃度為100mg/L的PMA，刺激48h后細(xì)胞形態(tài)學(xué)上轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形、梭形或伸出偽足，由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁狀態(tài)，表明THP-1細(xì)胞已成功轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，在巨噬細(xì)胞內(nèi)加入LPS（100ng/ml），共培養(yǎng)刺激6h建立炎癥模型。

1.2.2 分組及標(biāo)本選?。簩λ幬餄舛冗M(jìn)行篩選，將THP-1源巨噬細(xì)胞（1.0×105個細(xì)胞/孔）接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置APS各濃度梯度組（0mg/ml、0.02mg/ml、0.2mg/ml、2、20mg/ml、40mg/ml），每孔中各加入含不同濃度APS的新鮮培養(yǎng)基作用24h，分別收集各組細(xì)胞，提取RNA，進(jìn)行RT-PCR，篩選合適的APS濃度。實(shí)驗(yàn)分組：將造模細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1.0×105個細(xì)胞，分別設(shè)置為THP-1空白對照組、THP-1+LPS模型組、THP-1+LPS+APS低濃度組、THP-1+LPS+APS高濃度組，各組分別加入2mg/ml、20mg/mlAPS作用24h、48h，結(jié)束以后各自加入LPS（100ng/ml）刺激6h，并將提取的各組細(xì)胞置于EP管中，在7.500g、4℃下離心5min，并將各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液和THP-1源巨噬細(xì)胞收集起來。

1.2.3 RNA的提取、RT-PCR：提取各組細(xì)胞于EP管中，用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，用DNA/RNA計算器系列分光光度計進(jìn)行RNA濃度測定。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制15μl反應(yīng)體系，采用溫度梯度PCR儀逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計人TNF-α和IL-12、IL-10引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。應(yīng)用ABI7500 Real-Time PCR儀進(jìn)行檢測。RT-PCR反應(yīng)參照SYBR?Premix Ex Taq TM說明書進(jìn)行。使用ABI相對定量軟件進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果分析，基因相對表達(dá)量(處理組/未處理組)=2-ddCt，其中ddCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)未處理組。引物序列：TNF-α 5’GAC ACC ATG AGC CA GAA AG 3’5’GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC 3’IL-12 5’GAG AGT CAG AGG GGA CAA CAA 3’5’GTG AAC GGC ATC CAC CAT 3’IL-10 5’CCT GCC TAA CAT GCT TCGA 3’5’ATG TCT GGG TCT TGG TTC TCA 3’

1.3 觀察指標(biāo)：分述如下。

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞活力：通過光鏡觀察，確認(rèn)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。在96孔板中每孔（5000個細(xì)胞/孔）加入細(xì)胞懸液100μl，細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)孵育細(xì)胞24h，加入不同濃度的APS各10μl；繼續(xù)孵育一段時間后，再每孔加入CCK-810μl；繼續(xù)將細(xì)胞板放入培養(yǎng)箱中孵育1～4h；在酶標(biāo)儀上讀取OD450值、參考波長OD650值。存活率（%）=（ODTHP-1-ODAPS）/ODTHP-1×100%。

1.3.2 細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平：分別提取各組細(xì)胞總RNA后，用RT-PCR技術(shù)檢測IL-10、IL-12和TNF-αmRNA基因表達(dá)量。進(jìn)行產(chǎn)物熒光分析和融解曲線分析，基因相對表達(dá)量(處理組/未處理組)=2-ddCt，其中ddCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)處理組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)未處理組。

1.3.3 細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子含量：收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，分別用人TNF-α及IL-12、IL-10ELISA試劑盒檢測細(xì)胞因子表達(dá)水平并繪制出各細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子含量。

2 結(jié)果

2.1 炎癥模型：在熒光倒置顯微鏡下（放大40倍）可見THP-1細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓形、梭形或伸出偽足，并由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)為貼壁狀態(tài)，表明THP-1細(xì)胞已轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞。

2.2 不同APS濃度對THP-1源巨噬細(xì)胞活性的影響：用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，觀察不同濃度APS（0～40mg/ml）分別作用THP-1源巨噬細(xì)胞24h、48h后的細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，當(dāng)黃芪多糖濃度為2mg/ml和20mg/ml時，細(xì)胞存活率較高；當(dāng)黃芪多糖作用時間為48h時，細(xì)胞生存率低于50%，不利于細(xì)胞生長及后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。經(jīng)濃度篩選后，APS濃度為2mg/ml、20mg/ml時，THP-1巨噬細(xì)胞生存率較高且細(xì)胞因子的相對表達(dá)量較高且穩(wěn)定。

2.3 利用RT-PCR檢測IL-10、IL-12、TNF-α mRNA表達(dá)量并篩選出合適的藥物濃度：將空白THP-1源巨噬細(xì)胞分泌的各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量作為表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)量，IL-10、IL-12、TNF-α mRNA的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)量水平不盡相同。不論APS的高、低濃度，IL-12mRNA表達(dá)量均高于于空白對照組；且當(dāng)APS濃度在2mg/ml時，IL-12mRNA表達(dá)量顯著高于空白對照組。而IL-10及TNF-α mRNA表達(dá)量不呈濃度依賴性，兩者皆在APS濃度為在2mg/ml及在20mg/ml時表達(dá)量較高。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪圖結(jié)果可知，APS濃度為2mg/ml、20mg/ml時對THP-1源巨噬細(xì)胞增殖活力影響相對較小，故以2mg/ml、20mg/ml濃度的APS進(jìn)一步研究APS對各細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)的影響。

2.4 2mg/ml及20mg/ml濃度APS對各細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響：見表1。

表1 APS對LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)量影響（±s，pg/ml）

表1 APS對LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-12、TNF-α的表達(dá)量影響（±s，pg/ml）

注：同時間段，與THP-1空白對照組比較，*P＜0.05；與THP-1+LPS模型組比較，●P＜0.05；與同組24h比較，#P＜0.05。

組別THP-1空白對照組 (24h)THP-1+LPS模型組 (24h)THP-1+LPS+APS低濃度組（24h)THP-1+LPS+APS高濃度組（24h)THP-1空白對照組(48h)THP-1+LPS模型組(48h)THP-1+LPS+APS低濃度組（48h)THP-1+LPS+APS高濃度組（48h)TNF-αmRNA表達(dá)量1.0000±0.00000 1.1400±0.01732*1.9033±0.01528*●1.6833±0.01528*●1.2067±0.10066 2.2833±0.01528*2.3700±0.03000*#2.3133±0.04163*#n 3 3 3 3 3 3 3 3 IL-10mRNA表達(dá)量1.0000±0.00000 18.0367±0.16803*10.0367±0.17786*●5.0333±0.17243*●1.3933±0.03055 18.8000±0.20000*3.7667±0.25166*●#2.6333±0.35119*●#IL-12mRNA表達(dá)量1.0000±0.00000 4.4000±0.36056*9.4000±0.36056*●7.2333±0.25166*●1.6733±0.02517 10.9000±0.36056*13.9000±0.36056*●#12.8833±0.35473*●#

2.5 2mg/ml及20mg/ml濃度APS對IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表達(dá)水平的影響：見表2。

表2 APS對LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表達(dá)量影響（±s，pg/ml）

表2 APS對LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10、IL-12、TNF-α蛋白表達(dá)量影響（±s，pg/ml）

注：同時間段，與THP-1空白對照組比較，*P＜0.05；與THP-1+LPS模型組比較，●P＜0.05；與同組的24h比較，◆P＜0.05。

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3 討論

黃芪，具有益衛(wèi)固表、升陽舉陷，托毒生肌等功效，是臨床常用扶正抗癌中藥[1]。黃芪多糖（APS）作為黃芪的主要抗癌成分，已被證實(shí)可作為免疫調(diào)節(jié)劑，在抗腫瘤方面發(fā)揮積極作用[3-4]。細(xì)胞因子在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，主要參與吞噬病原體、殺傷腫瘤細(xì)胞，并可通過誘導(dǎo)抗腫瘤免疫長期維持或消除已形成的腫瘤來實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)控[5]。IL-12通過誘導(dǎo)輔助T細(xì)胞分化，促進(jìn)輔助Th1細(xì)胞增殖來參與細(xì)胞免疫，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制腫瘤血管生成，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。TNF-α是能抑制成骨細(xì)胞和刺激破骨細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，能直接殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞[6]，在分子水平發(fā)揮作用[7]。IL-10作為免疫抑制因子，通過抑制多種效應(yīng)分子來抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，通過誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-2，IFN-C，抑制IL-12及TNF-α的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。目前許多學(xué)者致力于研究中藥制劑中的有效成分是否能夠提高巨噬細(xì)胞活性，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫，但關(guān)于黃芪主要抗癌成分——黃芪多糖（APS）對人單核細(xì)胞株THP-1源巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用的研究尚無文獻(xiàn)報道?；诖耍緦?shí)驗(yàn)將APS作用于THP-1源巨噬細(xì)胞，運(yùn)用RT-PCR及ELISA法觀察其對經(jīng)LPS誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞的表達(dá)TNF-α和IL-12、IL-10的影響，以明確黃芪多糖對巨噬細(xì)胞免疫功能的確切影響。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一方面黃芪多糖能有效激活THP-1源巨噬細(xì)胞，下調(diào)其IL-10的基因表達(dá)量；并發(fā)現(xiàn)不同濃度APS對IL-10mRNA表達(dá)的下調(diào)作用呈一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）。此外，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞含量也進(jìn)一步驗(yàn)證了APS能夠降低由LPS刺激引起的IL-10表達(dá)的增加，這有可能是APS發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。另一方面黃芪多糖能有效激活THP-1源巨噬細(xì)胞，上調(diào)其IL-12、TNF-α的基因表達(dá)量，且兩者的表達(dá)量與APS的濃度與時間呈一定的依賴關(guān)系。這與APS對IL-10的調(diào)節(jié)作用相反，也體現(xiàn)了炎癥細(xì)胞因子在抗炎及促炎兩者之間的相互制約關(guān)系。

綜上，筆者通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖(APS)可能通過影響相關(guān)因子表達(dá)來調(diào)控機(jī)體免疫調(diào)節(jié)從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，且呈一定的濃度與時間依賴性，這為中藥黃芪及其有效抗腫瘤成分黃芪多糖在腫瘤免疫治療方面提供一定參考依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探索及驗(yàn)證。