王一鳴，龍勝舉，陳 延，賀忠群，*，趙英鵬，仰路希，嚴文一

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學院，四川 內(nèi)江 641000)

土壤酸化在自然界中普遍存在[1]，例如：大氣環(huán)境污染導致的酸沉降增加[2]、農(nóng)業(yè)上銨態(tài)氮肥等化學肥料的不當施用[3]、農(nóng)作物收獲后導致土壤中鈣、鎂、鉀等鹽基養(yǎng)分的減少等[4]。土壤酸化不僅會破壞土壤結(jié)構(gòu)[5]，導致礦質(zhì)營養(yǎng)元素的流失和重金屬的活化[6]，還會抑制土壤微生物活性[7]，從而影響作物對于土壤中營養(yǎng)元素的吸收利用。同時土壤酸化還會釋放出大量的活性鋁離子[8]，對根系的生長產(chǎn)生抑制[9]，破壞細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性[10]，破壞葉綠體被膜結(jié)構(gòu)導致葉綠素含量降低，使光合作用在一定程度上受到抑制[11]，從而降低作物的產(chǎn)量及品質(zhì)。中國酸化土壤總面積高達2.04×108hm2，約占全國土壤面積的22.7%，超過40%的耕地出現(xiàn)不同程度的酸化[12]，因此土壤酸化已經(jīng)成為了嚴重制約中國糧食安全、農(nóng)田和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的因素之一。

景天三七(SedumaizoonL.)又名費菜，景天科景天屬多年生草本植物，是一種從傳統(tǒng)繁育中篩選出來的野生蔬菜，富含三萜、甾醇、黃酮類等活性物質(zhì)[13]，具有保護心腦血管、促進血液循環(huán)、增強免疫力等保健功效[14]，目前已經(jīng)成為具有較高經(jīng)濟價值的綠色保健野生蔬菜[15]。景天三七在生產(chǎn)栽培中表現(xiàn)出了極強的抗逆性，但在生理逆境方面的研究較少。隨著景天三七栽培面積的越來越廣泛以及中國可耕地土壤酸化面積的逐步增加，研究土壤酸化對景天三七葉片光合及超微結(jié)構(gòu)的影響，可為景天三七在酸化土壤中的生產(chǎn)栽培提供一定的理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

土壤來自四川農(nóng)業(yè)大學，pH 6.6，速效氮53.6 mg·kg-1，速效磷44.1 mg·kg-1，速效鉀176.7 mg·kg-1，有機質(zhì)10.2 mg·kg-1。

植物為景天三七(SedumaizoonL.)，由四川農(nóng)業(yè)大學園藝學院提供。所有景天三七材料于5月中旬插繁殖20 d后得到。

1.2 實驗方法

將土壤風干過2 mm孔徑篩，取出部分土壤用稀釋后的濃硫酸預調(diào)酸，保濕并靜置7 d后，再次風干土壤測定pH，繪制土壤pH變化曲線，并計算出土壤調(diào)酸公式。根據(jù)得到的調(diào)酸公式對土壤進行調(diào)酸，得到土壤pH 3.4(重度)、pH 4.6(中度)、pH 5.5(輕度)、pH 6.6(CK)4個梯度的土壤，然后將株高4 cm的景天三七移栽到裝好不同土壤pH的營養(yǎng)缽(12 cm×13 cm)中培養(yǎng)，每個營養(yǎng)缽移栽1株并加入300 g該處理土壤，每個處理8盆每盆1株，重復3次，共96盆96株景天三七。將植株置于通風良好的塑料大棚中進行常規(guī)栽培，每個營養(yǎng)缽下放置托盤，在澆水的過程中做到少量多次，用土壤三參數(shù)儀測定土壤含水量，使其保持在75%左右，以使土壤pH保持穩(wěn)定，在28 d時測定相關(guān)的指標。

1.3 指標測定方法

1.3.1 土壤pH及鋁離子含量的測定

土壤pH的測定參考魯如坤[16]的方法；土壤中鋁離子含量測定使用百靈達便攜式土壤養(yǎng)分測定儀SKW500測定。

1.3.2 生理生化指標的測定

葉片相對電導率的測定參考王學奎[17]的方法；葉片可溶性糖含量的測定參考熊慶娥[18]的方法；葉片可溶性蛋白的測定參考熊慶娥[18]的考馬斯亮蘭G-250染色法；葉片丙二醛(MDA)含量的測定參考熊慶娥[18]的硫代巴比妥酸法；葉片游離脯氨酸含量的測定參考熊慶娥[18]的茚三酮比色法；葉綠素含量的測定采用直接浸提法[19]。

SOD活性的測定參考李合生[20]的方法；CAT活性的測定參考李忠光等[21]的方法；APX活性的測定參考Nakano等[22]的方法；GR活性的測定參照Ma等[23]的方法。

1.3.3 光合參數(shù)和葉綠素熒光參數(shù)測定

脅迫28 d時，在早上10:00采用透明葉室測定自然光照下的光合參數(shù)(光照強度為21 383 lx)，測定選取景天三七中上部生長健壯的成熟葉片，利用英國PPS公司生產(chǎn)的CIRAS-2型光合測定儀進行測定[24]。

用暗適應葉夾葉片30 min后，用PAM-2500熒光儀(Walz，Effeltrich，Germany)測定葉綠素熒光參數(shù)，Meas. Ligth int.設(shè)置為4檔，Act. Ligtht int.設(shè)置為9檔，Sat. Pulse int.設(shè)置為10檔，Slow Induction中Delay設(shè)置為40 s，Clock設(shè)置為20 s，Width設(shè)置為210 s，測定方法參照Cuddy等[25]。

1.3.4 葉片超顯微結(jié)構(gòu)的觀察

景天三七生長28 d后，取上部葉片和根尖，送四川大學電鏡室，采用透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，對有顯著差異(P<0.05)的處理采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酸化對土壤中鋁離子含量、葉片細胞相對電導率和丙二醛含量的影響

由表1可知，土壤中鋁離子含量、葉片細胞相對電導率和丙二醛含量隨著土壤酸化程度加深而迅速升高，在pH 4.6和pH 3.4的土壤中鋁離子含量分別是CK的43倍和120倍，但在pH 5.5輕度酸化情況下則與CK無顯著差異。

2.2 土壤酸化對景天三七葉光合特性的影響

總?cè)~綠素含量隨著土壤酸化程度的加深而逐漸降低，但對輕度和中度酸化下的光合參數(shù)沒有顯著影響；而在重度酸化下，光合速率、胞間CO2濃度、蒸騰速率、氣孔導度則比CK顯著降低了70.6%、67.1%、77.4%、80.5%，氣孔限制值顯著升高64.7%(表2)。

植株的熒光參數(shù)在輕度和中度酸化下與CK相比沒有顯著差異，但在重度酸化下，初始熒光Fo、最大熒光Fm、光化學效率ΦPSⅡ、光化學淬滅qP、光系統(tǒng)Ⅱ最大光合效率Fv/Fm迅速降低，非光化學淬滅NPQ則顯著升高(表3)。

表1 土壤酸化對景天三七葉片相對電導率、丙二醛和土壤中鋁離子含量的影響

Table1Effect of soil acidification on relative conductivity and the content of MDA ofSedumaizoonL. leaves and aluminum ions in soil

處理Treatment鋁離子含量Aluminum ions content/(mg·kg-1)相對電導率Relative conductivity/%丙二醛MDA content/(μmol·g-1)pH 3.464.01±3.17 a32.67±1.53 a0.24±0.05 apH 4.622.92±2.16 b28.33±1.89 b0.17±0.01 bpH 5.50.78±0.06 c25.00±1.73 c0.13±0.01 cpH 6.60.53±0.03 c24.33±2.52 c0.14±0.01 c

同列不同行處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

The values in the same column without the same lowercase letters showed the significant difference(P<0.05). The same as below.

表2 土壤酸化對景天三七葉葉綠素含量及光合參數(shù)的影響

Table2Effect of soil acidification on chlorophyll content and photosynthetic parameters inSedumaizoonL.

處理Treatment凈光合速率Pn/(μmol·m-2·s-1)胞間CO2濃度Ci/(μmol·mol-1)蒸騰速率Tr/(mmol·m-2·s-1)氣孔導度Gs/(mol·m-2·s-1)氣孔限制值Ls總?cè)~綠素含量Total chlorophyllcontent/(mg·g-1)pH 3.42.82±0.76 b65.57±24.72 b0.45±0.19 b0.015±0.001 b0.84±0.11 a1.30±0.06 cpH 4.68.51±0.63 a173.83±12.64 a2.08±0.09 a0.081±0.001 a0.58±0.05 b1.61±0.09 bpH 5.59.09±1.25 a187.20±24.57 a2.11±0.31 a0.077±0.011 a0.52±0.06 b1.81±0.08 bpH 6.69.58±0.80 a199.08±25.91 a1.99±0.19 a0.077±0.001 a0.51±0.04 b2.28±0.13 a

表3 土壤酸化對景天三七葉片熒光參數(shù)的影響

Table3Effect of soil acidification on leaf fluorescence parameters inSedumaizoonL.

處理Treatment初始熒光Fo最大熒光Fm光系統(tǒng)Ⅱ?qū)嶋H光化學效率ΦPSⅡ光化學淬滅qP非光化學淬滅NPQ光系統(tǒng)Ⅱ最大光合效率Fv/FmpH 3.40.424±0.011 b1.64±0.08 b0.236±0.015 b0.429±0.099 b1.12±0.25 a0.741±0.012 bpH 4.60.497±0.030 a2.25±0.14 a0.505±0.036 a0.724±0.027 a0.51±0.15 b0.779±0.013 apH 5.50.500±0.019 a2.35±0.06 a0.513±0.039 a0.740±0.052 a0.70±0.08 b0.787±0.008 apH 6.60.488±0.016 a2.32±0.15 a0.472±0.016 a0.698±0.075 a0.61±0.11 b0.789±0.021 a

2.3 土壤酸化對景天三七葉片超顯微結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可以看出，在CK、輕度和中度酸化下，葉綠體沿細胞膜均勻分布，呈橢圓形，內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，基粒片層結(jié)構(gòu)規(guī)則有序，平行排列，沒有出現(xiàn)明顯變形或片層之間出現(xiàn)明顯間隙，嗜鋨顆粒體積都相對較小，但數(shù)量相對較多；而在重度酸化下，葉綠體寬度增加并脫離細胞膜，在細胞質(zhì)中扎堆分布，發(fā)生不同程度的腫脹變形，外背膜出現(xiàn)模糊的現(xiàn)象，基粒所占體積變小，片層間出現(xiàn)明顯間隙，類囊體間出現(xiàn)扭曲或者變形，部分類囊體膜糊不清，嗜鋨顆粒明顯增大，但數(shù)量相對減少。CK中葉綠體內(nèi)淀粉粒含量較少且體積較??；輕度和中度酸化下，淀粉粒則大小不一，但在葉綠體內(nèi)均有分布；重度酸化下，淀粉粒大量增加且體積較大，占據(jù)了葉綠體接近一半或四分之三容積。

a，葉綠體；b，淀粉粒；c，嗜鋨顆粒；d，基粒片層；e，線粒體；f，葉綠體緊貼細胞膜；g，細胞間隙。a， Chloroplast；b， Starch granule；c， Osmiophilic particles；d， Grana lamella；e， Mitochondria；f， Chloroplast was close to the cell membrane；g， Intercellular.圖1 土壤酸脅迫對景天三七葉片超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of soil acidification on ultrastructure of Sedum aizoon L. leaves

2.4 土壤酸化對植株葉片滲透調(diào)節(jié)和抗氧化酶活性的影響

在輕度酸化下，葉片內(nèi)可溶性糖含量比CK顯著升高26%，其他滲透調(diào)節(jié)指標與CK無顯著差異。隨著土壤酸化程度的加劇，可溶性蛋白、游離脯氨酸含量顯著增加，葉片可溶性糖含量則迅速降低(表4)。

SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶活性隨著土壤酸化程度加深而迅速升高，但在輕度酸化下，除CAT活性比CK顯著增高12.3%外，其他抗氧化酶活性與CK則無顯著差異(表5)。

表4 土壤酸化對景天三七葉片滲透調(diào)節(jié)的影響

Table4Effect of soil acidification on leaf osmotic regulation inSedumaizoonL.

處理Treatment可溶性糖Soluble sugar content/(μg·g-1)可溶性蛋白Soluble protein content/(mg·g-1)游離脯氨酸Free proline content/(μg·g-1)pH 3.472.09±7.44 c1.65±0.03 a147.58±11.25 apH 4.675.36±7.88 c1.32±0.36 b120.94±7.83 bpH 5.5155.61±10.70 a0.72±0.09 c102.01±1.23 cpH 6.6115.52±5.32 b0.73±0.16 c98.38±8.91 c

表5 土壤酸化對景天三七葉片抗氧化酶活性的影響

Table5Effect of soil acidification on leaf antioxidant enzyme activity inSedumaizoonL.

處理Treatment超氧化物歧化酶SOD/(U·g-1)過氧化物酶CAT/(U·g-1)抗壞血酸過氧化物酶APX/(U·g-1)谷胱甘肽還原酶GR/(U·g-1)pH 3.4512.40±14.41 a289.65±11.70 a71.57±8.43 a22.79±2.58 apH 4.6439.64±18.55 b272.08±7.98 a52.92±4.56 b15.23±3.42 bpH 5.5355.96±20.00 c210.01±14.77 b39.83±6.23 c9.43±1.49 cpH 6.6339.79±15.05 c187.08±6.47 c34.09±2.08 c9.16±2.06 c

3 討論

有研究表明，鋁離子作為潛性酸的主要交換來源，土壤中鋁離子含量的增加是土壤酸化的結(jié)果，不是其酸化的原因[28]。本實驗進行土壤調(diào)酸后測定鋁離子含量發(fā)現(xiàn)在土壤pH低于4.6以后鋁離子溶出量急劇增加，實驗結(jié)果與Rosenberg等[26]相似。丙二醛(MDA)和細胞相對電導率的變化可以反映出細胞膜脂的過氧化程度以及質(zhì)膜透性變化所導致的電解質(zhì)外滲情況[27]，在中度和重度酸化下，植株丙二醛(MDA)含量和細胞相對電導率顯著增加，表明在一定鋁離子濃度的作用下植株細胞膜脂受到了不同程度的氧化作用，其中重度酸化強于中度酸化。

植物的滲透調(diào)節(jié)、抗氧化酶活性變化以及膜脂過氧化作用已廣泛用于對植物逆境反應機制的研究?？扇苄蕴?、可溶性蛋白、游離脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在逆境脅迫下調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透勢及維持細胞內(nèi)相關(guān)代謝功能的正常進行發(fā)揮著重要的作用[28]。SOD、CAT、APX、GR等抗氧化酶在平衡細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基及清除上是植株體內(nèi)不可缺少的酶類。實驗結(jié)果表明，隨著土壤酸化程度加劇，除了可溶性糖含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢外，其他的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及抗氧化酶活性均不斷增加以保護或減輕細胞膜脂受到的過氧化作用，維持細胞內(nèi)外滲透調(diào)節(jié)的平衡，特別是中度和重度酸化下的可溶性蛋白、游離脯氨酸和抗氧化酶活性顯著高于CK，表明在土壤pH低于4.6以后，土壤酸脅迫會導致景天三七葉片細胞的膜質(zhì)過氧化，并對細胞的正常生理代謝造成影響。

通過對葉綠素含量、光合及熒光參數(shù)的測定發(fā)現(xiàn)，雖然土壤酸化導致葉片內(nèi)葉綠素含量的降低，但在輕度和中度酸化條件下植株光合作用能正常進行。只有當土壤pH低于4.6達到重度酸化后，Pn、Gs、Ci、Tr、Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP、Fm才迅速降低，Ls、NPQ則顯著升高。這表明重度酸化導致光系統(tǒng)Ⅱ反應中心遭到破壞或可逆失活，光合電子傳遞活性受到抑制，植株光合能力遭到嚴重抑制，這與井大煒等[29]的結(jié)果相似。

而對葉片的超顯微結(jié)構(gòu)進行觀察發(fā)現(xiàn)，在CK、輕度和中度酸化下，葉綠體沿細胞膜均勻分布，結(jié)構(gòu)完整，基粒片層結(jié)構(gòu)規(guī)則有序，以利于最大程度接受光能進行光合作用；而在重度酸化下，葉綠體不再沿著細胞膜均勻分布，并在細胞質(zhì)中扎堆聚集，并且葉綠體外背膜出現(xiàn)模糊，基粒片層間出現(xiàn)明顯間隙，部分類囊體變得膜糊不清，這可能是無法及時清除的活性氧自由基對葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴重破壞。綜上所述，為保證景天三七光合代謝的正常進行以及葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的完整，植株栽培的土壤pH不應低于4.6。