蘇碧雅，張黎明，楊梅珍，邵發(fā)林（天水市第一人民醫(yī)院藥劑科，甘肅天水741000）

喹諾酮類抗菌藥物是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，屬濃度依賴型抗菌藥，第三代喹諾酮類抗菌藥物對革蘭氏陽性、陰性菌均有較明顯的抗菌后效應[1]。左氧氟沙星是臨床常用的治療肺部感染的抗菌藥物，在耐藥結(jié)核桿菌感染的治療中也被廣泛使用，其給藥方案多參照血液中的藥動學參數(shù)制訂。有關左氧氟沙星血藥濃度的高效液相色譜法（HPLC）已有很多報道[2-4]，但血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)與胸腔積液不同，故左氧氟沙星血藥濃度監(jiān)測的HPLC法并不能直接用于左氧氟沙星胸腔積液樣品的檢測，且血漿中左氧氟沙星的藥動學研究也并不能準確反映肺組織中左氧氟沙星的分布情況，因此對感染部位的藥物濃度進行測定，具有更大的臨床意義。但目前國內(nèi)尚無文獻報道人用左氧氟沙星后，左氧氟沙星在肺部的藥動學特征。胸腔積液（Pleural effusion）是以胸膜腔內(nèi)病理性液體積聚為特征的一種常見的臨床癥候，對該類患者胸腔積液中左氧氟沙星的藥動學進行研究，再根據(jù)檢測結(jié)果結(jié)合藥動學/藥效學理論以及病原菌最低抑菌濃度（MIC）綜合分析，能指導臨床醫(yī)師更合理、準確地使用左氧氟沙星，保證用藥有效性和安全性。故本文采用HPLC外標法，用甲醇沉淀胸腔積液中蛋白質(zhì)后，測定左氧氟沙星的含量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260液相系統(tǒng)，包括二極管陣列檢測器（美國Agilent公司）；TD4B臺式低速自動平衡離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；UPD-?-10T小型純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；MD200-2氮吹儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）；AUY220分析天平（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

左氧氟沙星對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130455，純度：97.1%）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 胸腔積液來源

本文選擇的研究對象為我院呼吸內(nèi)科收治的6名感染性胸腔積液患者，所采集的胸腔積液為滲出液，研究患者入選標準為（1）肺部感染患者；（2）經(jīng)胸部CT檢查，胸腔積液量達到250 mL以上，可以行胸腔穿刺置管引流術者；（3）靜脈滴注左氧氟沙星注射液進行抗感染治療，給藥劑量為0.4 g qd的患者；（4）配合度良好，能保證按時取樣的患者。排除標準為（1）單純性結(jié)核性胸腔積液患者；（2）單純性腫瘤性胸腔積液患者；（3）其他原因不明的胸腔積液患者。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液[含0.3%三乙胺，70 ∶30（V/V）] ；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：294 nm；進樣量：20 μL。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取左氧氟沙星對照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得400 μg/mL的左氧氟沙星甲醇貯備液，置于4℃冰箱保存。臨用前將該貯備液用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列對照品溶液即可。

2.3 胸腔積液樣品的前處理方法

取胸腔積液樣品500 μL，置于離心管中，加甲醇2 000 μL，渦旋混合3 min，4 000 r/min離心15 min后，取上清液于另一離心管中，在相同條件下二次離心，取上清液，用氮吹儀揮干甲醇后，加入500 μL甲醇復溶，渦旋混合均勻后用0.25 μm的微孔濾膜濾過，置于自動進樣分析小瓶中，吸取20 μL進樣分析。

2.4 專屬性考察

取對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。另取6名感染性胸腔積液患者使用左氧氟沙星前抽取的胸腔積液的混合液（簡稱空白胸腔積液）、空白胸腔積液+對照品、胸腔積液樣品（給藥后1 h），按照“2.3”項下方法處理后，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。

2.5 線性關系考察

取質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的對照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮吹儀揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，渦旋15 s混合均勻，配成含左氧氟沙星質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列質(zhì)控樣品，每個濃度平行做3份，按照“2.3”項下方法處理后，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，重復3次，取平均值。以左氧氟沙星峰面積（A）為縱坐標，質(zhì)量濃度（c）為橫坐標，進行回歸分析。

2.6 檢測限與定量下限考察

將質(zhì)量濃度為0.625 μg/mL的對照品溶液，逐級稀釋后，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比為3∶1，確定左氧氟沙星的檢測限；以標準曲線的最低點為左氧氟沙星的定量下限。

2.7 相對回收率試驗

取質(zhì)量濃度為1.25、10、15 μg/mL的對照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮氣儀揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，制成質(zhì)量濃度分別為1.25、10、15 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個濃度平行做3份，按照“2.3”項下方法處理后，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積A1。取空白胸腔積液適量，按照“2.3”項下方法處理后，加入對照品溶液制備成相應質(zhì)量濃度的溶液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積A2。以A1/A2計算相對回收率。

2.8 精密度與準確度試驗

取質(zhì)量濃度為1.25、10、15 μg/mL的對照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮氣儀揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，制成質(zhì)量濃度分別為1.25、10、15 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個濃度平行做5份，按照“2.3”項下方法處理后，再按照“2.1”項下色譜條件進樣，同一天內(nèi)測定3次考察日內(nèi)精密度；每天測定1次，連續(xù)測定3 d，考察日間精密度；將測得峰面積代入回歸方程計算左氧氟沙星的濃度，以實測值/加入值計算準確度。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取質(zhì)量濃度為1.25、10、15 μg/mL的對照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮氣儀揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，制成質(zhì)量濃度分別為1.25、10、15 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個濃度平行做15份，取3份按“2.3”項下方法處理后立即進樣分析；3份室溫下放置4 h后按“2.3”項下方法處理后進樣分析；3份按“2.3”項下方法處理后再置于4℃冰箱放置12 h后進樣分析；3份于冰箱中冷凍保存4周后取出融化，再按“2.3”項下方法處理后進樣分析；3份反復凍融3次后再按“2.3”項下方法處理后進樣分析，考察穩(wěn)定性。

2.10 藥動學考察

按“2.3”項下方法處理6名感染性胸腔積液患者靜脈滴注左氧氟沙星0.4 g qd后0.5、1、2、4、8、12、24 h的胸腔積液，再按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算濃度。使用GraphPad軟件繪制胸腔積液中左氧氟沙星的藥-時曲線，將上述濃度數(shù)據(jù)代入WinNonlin 5.2軟件計算藥動學參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 專屬性

在“2.1”項色譜條件下，左氧氟沙星的保留時間為4.9 min左右，峰形良好，與前后鄰近峰能有效分離，胸腔積液中內(nèi)源性物質(zhì)對其測定無干擾，基線平穩(wěn)。色譜圖見圖1。

3.2 線性關系

得回歸方程為A＝40.71c+1.640 3（R2＝0.998 9），胸腔積液中左氧氟沙星檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.625～20 μg/mL。

3.3 檢測限與定量下限

胸腔積液中左氧氟沙星的檢測限為0.156 μg/mL，定量下限為0.625 μg/mL。

3.4 相對回收率

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品中左氧氟沙星的相對回收率均在80%以上，符合相關要求規(guī)定。相對回收率結(jié)果見表1。

表1 相對回收率結(jié)果（n＝3）Tab 1Results of relative recovery rate（n＝3）

3.5 精密度和準確度

結(jié)果顯示，測得濃度的日內(nèi)、日間RSD均小于5%，準確度在（97.76±4.85）%～（100.87±2.25）%范圍內(nèi)，均符合相關規(guī)定。精密度與準確度結(jié)果見表2。

表2 精密度與準確度結(jié)果（n＝5）Tab 2Results of precision and accuracy（n＝5）

3.6 穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，測定濃度的RSD均小于5%，質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果（n＝3）Tab 3Results of stability（n＝3）

3.7 藥動學

胸腔積液中左氧氟沙星的藥-時曲線見圖2，藥動學參數(shù)見表4。

4 討論

4.1 檢測波長的確定

2015年版《中國藥典》記錄的左氧氟沙星HPLC法中紫外檢測波長為294 nm和238 nm[5]。本文前期研究發(fā)現(xiàn)，檢測波長為294 nm時胸腔積液內(nèi)源性物質(zhì)對左氧氟沙星出峰干擾最小，靈敏度較高，所以本文最終選取294 nm作為左氧氟沙星的檢測波長。

圖2 胸腔積液中左氧氟沙星的藥-時曲線Fig 2 Plasma concentration-time curve of levofloxacin in pleural effusion

表4 胸腔積液中左氧氟沙星的藥動學參數(shù)（n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameter of levofloxacin in pleural effusion（n＝6）

4.2 柱溫的選擇

在HPLC法檢測中，提高柱溫可以降低流動相的黏度、增加樣品在流動相中的溶解度、縮短樣品的保留時間，故控制柱溫可調(diào)整待測物質(zhì)出峰時間。經(jīng)過對不同柱溫的測試，比較了柱溫為25、30、35℃時左氧氟沙星的吸收峰的峰形、拖尾因子及與其他峰的分離度等，同時考慮到柱溫過高可能縮短色譜柱壽命、影響生物樣品的穩(wěn)定性，故最終柱溫定為35℃。

4.3 蛋白沉淀劑的選擇

甲醇和乙腈為HPLC檢測最常用的兩種有機流動相，選擇甲醇和乙腈為蛋白沉淀劑可以最大程度的減少溶劑效應的影響，故本研究選擇蛋白沉淀劑時分別試用了乙腈和甲醇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈和甲醇作為蛋白沉淀劑均能滿足相關要求，但考慮到甲醇毒性較乙腈低，故選擇甲醇作為本實驗的蛋白沉淀劑。體外藥物分析時一般采用外標法，體內(nèi)藥物分析因提取步驟煩瑣，都采用內(nèi)標法進行校正，但因為本方法僅使用4倍體積甲醇沉淀蛋白，無提取等煩瑣步驟，而且儀器穩(wěn)定性、方法的精密度均良好，故選擇用外標法進行定量測定。

4.4 方法實用性

左氧氟沙星為臨床常用的喹諾酮類抗菌藥物，抗菌譜廣，可用于治療銅綠假單胞菌引起的感染[6]、鮑曼不動桿菌引起的感染[7]，也可與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用用于治療耐藥結(jié)核菌感染[8]。左氧氟沙星在治療肺部、膽系、泌尿系、腸道等部位感染中使用廣泛，其在肺組織中濃度高，是治療肺部感染的常用抗菌藥物，但目前對左氧氟沙星肺部的藥動學研究多停留在動物實驗階段[9]。本研究以甲醇和磷酸二氫鉀緩沖液為流動相，以甲醇為沉淀劑，建立測定患者胸腔積液中左氧氟沙星濃度的HPLC法，樣品處理方便，出峰速度快，10 min即可完成1個樣品分析，分析成本較低，適用于臨床左氧氟沙星胸腔積液濃度測定及左氧氟沙星的肺部藥動學研究。