孫巧云/劉文杰/張新國/趙萍 蘭州理工大學(xué) 甘肅 蘭州 730050

朱建寧 甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局審評認證中心 蘭州 730070

龐雪茹 岷縣職業(yè)中等專業(yè)技術(shù)學(xué)校 岷縣 748400

細菌感染在臨床上很常見，β-內(nèi)酰胺類抗生素是最常用的抗菌劑[1]。臨床所見的耐藥菌約80%與β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生有關(guān)[2-3] 。以β-內(nèi)酰胺酶為靶點進行抗耐藥菌候選藥物的研究仍然是目前階段一個非常有效的手段[1-4]。β-內(nèi)酰胺類底物在β-內(nèi)酰胺酶的作用下生成青霉噻唑酸，可見光下具有不同的特征吸收峰，利用分光光度法可以測算β-內(nèi)酰胺酶的活性?；诖?，我項目組優(yōu)化前期成功建立的平板快速篩選方法[5]，搭建簡單、快速的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑篩選平臺，用來快速發(fā)現(xiàn)對其有效的抗生素或酶抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青霉素V鉀 阿拉丁試劑有限公司；β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)品 上海晶純實業(yè)有限公司；他唑巴坦(tazobactam) 含量≥98%，阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；pH計(pH-902) 泰州市正大科教儀器設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

PBS緩沖液：稱取Na2HPO420.66 g，NaH2PO46.59 g溶于100 mL雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH為7.0；待測物溶液：將待測物溶于無水PBS中，濃度為1 mg/mL。碘化物：稱取碘2 g，碘化鉀85.1 g溶于100mL PBS，儲存在棕色瓶中。淀粉-碘化物[7] ：稱取0.2 g淀粉溶解于100 mL PBS（0.1 mol/L）中，煮沸2 min，至澄清，然后冷卻至室溫。將150 μL碘化物加入100 mL 淀粉溶液，備用。

1.2.2 底物最佳檢測波長的確定

向1.6 mL淀粉-碘化鉀溶液中加入0.02 mg/mL青霉素V鉀1 mL和0.4 mL PBS緩沖液，在190-990 nm波長范圍內(nèi)，對樣品液進行全波長掃描，確定底物的最佳吸收波長。

1.2.3 最適青霉素V鉀濃度的確定

實驗選取青霉素V鉀為底物。維持反應(yīng)總體積加量不變，取1.6 mL碘-淀粉溶液和400 μL PBS緩沖液于試管中，依次加入1.0 mL，0.02 mg/mL、0.07 mg/mL、0.12 mg/mL、0.17 mg/mL、0.22mg/mL、0.27 mg/mL青霉素V鉀，在571 nm處每10 s測定一次吸光值，共測定300 s，以確定青霉素V鉀的最適濃度。

1.2.4 最適β-內(nèi)酰胺酶濃度的確定

取1.6 mL碘-淀粉溶液，1.0 mL青霉素V鉀和300 μL PBS緩沖液于試管中，分別加入100uL，20U/mL、70 U/mL、120 U/mL、170 U/mL、220 U/mL、270 U/mL β-內(nèi)酰胺酶。同1.2.3所示進行測定，以確定β-內(nèi)酰胺酶的最適濃度。

1.2.5 最適陽性藥物濃度的確定

取1.6 mL碘-淀粉、1 mL青霉素V鉀和100μL酶于試管中，分別加入300 μL，0.002 mg/mL、0.006 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.05 mg/mL、0.08 mg/mL對照品，依照1.2.3所述方法計算不同濃度的抑制率，確定抑制劑的最適濃度。

1.2.6 β-內(nèi)酰胺酶篩選平臺的驗證及抑制劑的篩選

確定最佳條件后，對1.2.5所示體系，平行試驗三次，根據(jù)直線斜率的變化計算化合物的抑制活性，公式如下：

對實驗室之前保藏的200個植物內(nèi)生真菌，采用1.2.5建立的方法進行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 底物最佳檢測波長的確定

在190-990 nm波長范圍內(nèi)，在571 nm顯示最大吸收峰值，具有較高吸收度和精確性，因此，571 nm可以作為β-內(nèi)酰胺酶抑制劑活性檢測的最適波長。

圖1 底物溶液全波長掃描結(jié)果

2.2 最適青霉素V鉀濃度的確定

隨著青霉素V鉀濃度的增大，體系的降解速率增大（表1）。青霉素V鉀濃度0.02 mg/mL時，幾乎沒有降解且判定系數(shù)R2最高，達到0.9996，呈現(xiàn)非常高的相關(guān)性。故選取青霉素V鉀濃度為0.02 mg/mL。

表1 不同濃度的青霉素V鉀的紫外測試結(jié)果

2.3 最適β-內(nèi)酰胺酶濃度的確定

不同濃度的β-內(nèi)酰胺酶，對反應(yīng)體系影響顯著。隨著酶濃度的增大，酶促反應(yīng)初速率呈現(xiàn)先升高后平緩的趨勢（表2）。在酶濃度為20 U/mL，雖然反應(yīng)初期線性關(guān)系較好，但是酶促反應(yīng)速度只達到0.0189 mmol·min-1。在酶濃度為70 U/mL，酶反應(yīng)初速率達到最高值0.0482 mmol·min-1，且判定系數(shù)R2達到0.9804。故選取酶濃度為70 U/mL。

表2 不同濃度的β-內(nèi)酰胺酶的紫外測試結(jié)果

2.4 最適陽性藥物濃度的確定

由表3可知，隨著抑制劑濃度的增大，抑制率先增大后趨于平緩。當(dāng)抑制劑濃度大于0.03 mg/mL，各組抑制率接近?？紤]實驗成本，故選擇抑制劑濃度為0.03 mg/mL。

表3 不同濃度陽性藥物的紫外測試結(jié)果

2.5 β-內(nèi)酰胺酶篩選平臺的驗證及抑制劑的篩選

對β-內(nèi)酰胺酶抑制劑篩選平臺進行三次平行驗證，三次的抑制劑率分別為82.0%，80.8%，81.7%，幾乎無差別且R2分別為0.9955，0.9959，0.9954，較好的相關(guān)性，證明了篩選平臺的穩(wěn)定。隨后對200個備用的發(fā)酵液進行篩選。抑制率低于60%有181個，60% ～ 90% 有17個；90%以上有2個。篩選得到2個對β-內(nèi)酰胺酶具有高抑制活性的樣品。

3 結(jié)論

確定篩選平臺最佳方案為：最大吸收波長為571 nm，青霉素V鉀濃度為0.02 mg/mL，酶濃度為70 U/mL，他唑巴坦?jié)舛葹?.03 mg/mL。