楚秉泉,方若思,李 玲,肖功年,袁海娜,龔金炎

(浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023)

自由基如氧自由基(ROS)導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性、DNA損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化是誘發(fā)疾病、加速衰老的重要原因[1-2]。正常情況下,代謝產(chǎn)生的過(guò)量自由基可被機(jī)體內(nèi)多種抗氧化防御系統(tǒng)清除,進(jìn)而預(yù)防氧化應(yīng)激損傷的發(fā)生[3]。而當(dāng)機(jī)體處于不良環(huán)境或受到如輻射、缺氧、藥物、香煙煙霧和光化學(xué)空氣污染物等作用時(shí),均可能造成大量自由基的產(chǎn)生,威脅人類健康[4]。因此,適當(dāng)補(bǔ)充抗氧化劑,清除體內(nèi)過(guò)量的自由基,維持機(jī)體氧化還原平衡,對(duì)疾病防護(hù)和人體健康具有很大的益處。

洋甘菊(MatricariarecutitaL.)又稱母菊,為菊科甘菊屬一年生或多年生草本植物,在德國(guó)、東歐、比利時(shí)、北美、英國(guó)等地區(qū)廣泛分布,在我國(guó)北方和南方也有種植[5],是一種重要的藥用植物和香料原料[6],多以其花序或全草入藥。洋甘菊甘香味微苦,含有豐富的生物活性物質(zhì)。從洋甘菊花序中提煉的精油,主要成分為萜類化合物、沒(méi)藥醇、母菊蘭烯等,具有消炎、抗過(guò)敏、解痙、抑菌、清熱、治療潰瘍等功效[7-9];洋甘菊醇提取液富含的酚酸、香豆素類和黃酮類化合物,具有抗氧化、保肝護(hù)肝、抗血管增生、消炎、抗變應(yīng)性和抗病毒等功效[10-11]。但目前研究多集中于洋甘菊水提物或醇提物的功能評(píng)價(jià)[12-13],少有涉及洋甘菊提取物不同部位的抗氧化活性以及相關(guān)化學(xué)成分的深入分析研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

洋甘菊 杭州藝福堂茶業(yè)有限公司;新綠原酸、綠原酸、1,3-二咖啡酰奎寧酸、木犀草素-7-葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、木犀草素和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于98%) 上海永恒生物科技有限公司;乙腈(色譜純) 德國(guó)Merck公司;DPPH·、ABTS+·、TPTZ、Trolox、NBT、PMS、NADH等 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;無(wú)水乙醇、石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇、氯化鐵、過(guò)硫酸鉀等 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BSA124s精密分析天平 賽多利斯(Sartorius)科學(xué)儀器(北京)有限公司;KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Waterse2695高效液相色譜儀(含自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、2998光電二極管陣列檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司;Eon型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰(BioTek)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 洋甘菊有效成分的提取 洋甘菊50 ℃烘干后粉碎,過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取200.0 g洋甘菊粉,用無(wú)水乙醇(料液比=1∶10 g/mL)浸泡24 h后,120 W超聲提取30 min,抽濾。濾渣用無(wú)水乙醇重復(fù)超聲提取1次。合并濾液,40 ℃減壓濃縮至浸膏(無(wú)醇味),回收乙醇。浸膏用純凈水重新分散溶解,依次用體積比為1∶1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取4次,即得石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和剩余水相。分別40 ℃減壓濃縮至干后,-40 ℃冷凍干燥36 h。各凍干物用甲醇配制成相應(yīng)濃度的待測(cè)樣本,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 各提取組分的抗氧化活性

1.2.2.1 DPPH·清除實(shí)驗(yàn) 用甲醇配制0.10 mmol/L的DPPH·溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)樣本與3.9 mL DPPH·溶液混勻;待測(cè)樣空白對(duì)照組為相應(yīng)質(zhì)量濃度待測(cè)樣本0.1 mL加入3.9 mL甲醇;DPPH·空白對(duì)照組為3.9 mL DPPH·加入0.1 mL甲醇。室溫下避光反應(yīng)30 min后,在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。另以不同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照[14]。按下列公式計(jì)算各樣本的DPPH·清除率,并計(jì)算各待測(cè)樣本的半抑制濃度(IC50)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

DPPH·清除率(%)=[1-(A待測(cè)樣-A待測(cè)樣空白對(duì)照)/ADPPH·空白對(duì)照]×100

1.2.2.2 ABTS+·清除實(shí)驗(yàn) 用純水配制2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀和7 mmol/L ABTS+·混合溶液。室溫下避光靜置16 h,制成ABTS+·儲(chǔ)備液。臨用前用純水稀釋至吸光值為0.700±0.02(734 nm)的ABTS+·工作液。分別取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)樣本加入3.9 mL的ABTS+·工作液;待測(cè)樣空白對(duì)照組為相應(yīng)質(zhì)量濃度待測(cè)樣本0.1 mL加入3.9 mL的純水;ABTS+·空白對(duì)照組為3.9 mL ABTS+·工作液加入0.1 mL甲醇?；靹蚝笫覝叵路磻?yīng)6 min,在734 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。另以不同質(zhì)量濃度的VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按下列公式計(jì)算各樣本的ABTS+·清除率,并計(jì)算各待測(cè)樣本的半抑制濃度(IC50)[14]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

ABTS+·清除率(%)=[1-(A待測(cè)樣-A待測(cè)樣空白對(duì)照)/AABTS·空白對(duì)照]×100

1.2.2.4 FRAP法測(cè)定還原能力 參考文獻(xiàn)[15]方法,略有修改。配制100 mmol/L醋酸緩沖液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液(40 mmol/L鹽酸溶液配制)和20 mmol/L氯化鐵溶液,按10∶1∶1的比例進(jìn)行混勻后得RFAP工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。取3.9 mL RFAP工作液,加入0.1 mL 0.5 mg/mL的待測(cè)樣本(濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得),混合均勻后,在37 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)10 min后于593 nm下測(cè)定吸光度值,以甲醇為空白對(duì)照。結(jié)果表達(dá)為每克干重相當(dāng)于Trolox還原力的相當(dāng)量(mg trolox equivalent antioxidant capacity/g dry weight,mg TEAC/g DW)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 最佳抗氧化活性組分成分分析 將抗氧化活性最佳的萃取相(乙酸乙酯萃取相)冷凍干燥后用甲醇配制10 mg/mL樣本,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.1 總黃酮和總酚的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[16]方法,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法(510 nm)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定乙酸乙酯萃取相中的總黃酮含量(%);以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,福林酚顯色法(570 nm)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定乙酸乙酯萃取相中的總酚含量(%)。

1.2.3.2 多酚化合物組分分析 用甲醇配制新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、木犀草素-7-葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸C、1,3-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷、木犀草素和芹菜素標(biāo)準(zhǔn)品的混合溶液,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

液相色譜條件及測(cè)定方法:色譜柱為L(zhǎng)una-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A:乙腈,流動(dòng)相B:0.1%磷酸溶液。流速0.8 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm,進(jìn)樣量10 μL,柱溫35 ℃,梯度洗脫條件見(jiàn)表1。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量待測(cè)樣本中多酚成分組成。

表1 流動(dòng)相梯度條件Table 1 HPLC gradient elution conditions

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 洋甘菊醇提物各萃取相的抗氧化活性比較

圖1 洋甘菊醇提物不同極性組分對(duì)DPPH·的清除作用

圖2 洋甘菊醇提物不同極性組分對(duì)ABTS+·的清除作用

圖3 洋甘菊醇提物不同極性組分對(duì)的清除作用 scavenging capacity of different polar fractions of chamomile alcohol extracts

表2 洋甘菊醇提物不同極性組分的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activities of different polar fractions of chamomile alcohol

2.2 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中總酚和總黃酮含量

多酚和黃酮具有多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu),是天然產(chǎn)物中主要的抗氧化成分之一,具有豐富的藥理活性[17-18]。實(shí)驗(yàn)采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法(以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品)和福林酚顯色法(以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品)分別對(duì)洋甘菊抗氧化活性最強(qiáng)的乙酸乙酯萃取相中的總黃酮和總酚含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明,蘆丁和沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.0761x+0.001(R2=0.9936)和y=0.1852x+0.0057(R2=0.9996),以此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得總酚和總黃酮含量分別為25.84%和14.93%(圖4),推測(cè)該萃取相較強(qiáng)的抗氧化活性可能與其豐富的酚類和黃酮類化合物有關(guān)。

圖4 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中總酚和總黃酮含量(n=3)

2.3 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中多酚或黃酮成分分析

進(jìn)一步采用HPLC法分析乙酸乙酯組分中的多酚或黃酮成分(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1,3-二咖啡?？鼘幩?、木犀草素-7-葡萄糖、異綠原酸B、異綠原酸C、蒙花苷、木犀草素和芹菜素)的含量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品與樣本HPLC圖譜中保留時(shí)間及各色譜峰的紫外吸收譜吻合度比對(duì)(圖5),結(jié)合外標(biāo)法對(duì)樣本中10種多酚或黃酮成分進(jìn)行定性定量分析,結(jié)果如表3所示。10種化合物在洋甘菊中均被檢出,采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定各組分的含量。結(jié)果表明,洋甘菊乙酸乙酯組分中木犀草素含量最高,為7.057 mg/g DW,其次是蒙花苷和木犀草素-7-葡萄糖,分別為5.736和5.605 mg/g DW(表3),而這些化合物均被報(bào)道具有較好的抗氧化活性[19-21],表明洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分良好的抗氧化能力可能與其豐富的多酚和黃酮有關(guān)。

圖5 待測(cè)樣本(A)和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(B)的HPLC圖

表3 洋甘菊醇提物的乙酸乙酯組分中多酚或黃酮成分及含量

出峰編號(hào)化合物出峰時(shí)間(min)含量(mg/g DW)1新綠原酸7.4210.295±0.0262綠原酸10.8584.389±0.2843隱綠原酸11.3611.328±0.08841,3-二咖啡?？鼘幩?5.3390.642±0.0535木犀草素-7-葡萄糖24.0295.605±0.3896異綠原酸B29.6611.340±0.0677異綠原酸C40.5343.094±0.1118蒙花苷46.3775.736±0.3459木犀草素48.0817.057±0.62810芹菜素53.7952.467±0.291

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用4種抗氧化評(píng)價(jià)方法，較系統(tǒng)地對(duì)比分析了洋甘菊醇提物不同極性(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、剩余水相)萃取組分的抗氧化活性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取相活性最佳。對(duì)乙酸乙酯萃取相中總酚和總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定,兩種成分分別為25.84%和14.93%,說(shuō)明洋甘菊是一種富含多酚和黃酮成分的植物;進(jìn)一步采用HPLC測(cè)定了乙酸乙酯萃取相中的10種多酚或黃酮類化合物,表明木犀草素、蒙花苷和木犀草素-7-葡萄糖含量較豐富。

在未來(lái)的研究中,我們將進(jìn)一步明確起主要抗氧化作用的多酚/黃酮類化合物及其量效關(guān)系;關(guān)于洋甘菊提取物的體內(nèi)抗氧化功能及其作用機(jī)制研究也將在后續(xù)的工作中展開(kāi)。