張寧龍,王文利,劉 源

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

隨著對(duì)生物活性肽的深入研究和認(rèn)識(shí),許多含有功能特性如提供營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)健康[1-2]、具有保健活性[3]和呈味特性[4]的短肽被報(bào)道。其中,呈味肽是從食品中分離或由氨基酸合成的對(duì)食品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)的分子質(zhì)量低于5000 u 的寡肽類物質(zhì)[5]。呈味肽對(duì)食品的貢獻(xiàn)呈多元化,除提供特征滋味外還可以作為風(fēng)味前體物質(zhì)參與美拉德反應(yīng)[6-7],即扮演特征滋味肽和風(fēng)味前體肽兩種角色[8]。目前已知的呈味肽主要有咸味肽[9-11]、酸味肽[12]、苦味肽[13-14]、甜味肽[15-17]和鮮味肽[18-20]等。在呈味肽家族中,有一種從牛肉木瓜蛋白酶水解液中分離鑒定的呈味八肽——牛肉風(fēng)味肽,因其具有典型的滋味特征而備受關(guān)注。

牛肉風(fēng)味肽(beefy meaty peptide,BMP),又稱美味提升肽(savory taste-enhancing peptide,STEP),1978年Yamasaki和Maekawa首次在牛肉中發(fā)現(xiàn)[21-23],現(xiàn)已作為鮮味肽收錄在生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/pl/biopep)。BMP具有良好的熱和pH穩(wěn)定性[24-25],且能穩(wěn)定地存在于脂肪等復(fù)雜體系中[22,26],能夠滿足多樣化的食品環(huán)境和加工要求,作為食品風(fēng)味劑的潛力巨大。目前有關(guān)BMP的研究,國(guó)外主要集中在其呈味特性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系上,如Tamura等[27]發(fā)現(xiàn)BMP的鮮味由N-端堿性氨基酸(Lys-Gly)和中間部分的酸性氨基酸(Asp-Glu-Glu)共同產(chǎn)生;國(guó)內(nèi)則側(cè)重于BMP的生物合成,如構(gòu)建BMP串聯(lián)基因并在畢赤酵母中高效表達(dá)[28]等方面。目前,BMP的呈味機(jī)制還不十分清晰,而BMP的滋味特性、生物源性等問(wèn)題的解決關(guān)系到其能否用于食品調(diào)味體系。

基于此,本文將闡述BMP的呈味特性、呈味機(jī)制和生物合成等方面的研究進(jìn)展和存在的問(wèn)題,以期全面解析BMP的特征,為推動(dòng)其在食品體系中的應(yīng)用提供一些借鑒和理論指導(dǎo)。

1 BMP的呈味特性

BMP是從牛肉的木瓜蛋白酶水解液中分離得到的“美味”八肽[21],氨基酸序列為L(zhǎng)ys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala,分子質(zhì)量847.39 u[25],等電點(diǎn)預(yù)測(cè)值4.1[29]。目前報(bào)道的BMP的呈味特性詳見(jiàn)表1。

表1 BMP的呈味特性 Table 1 Taste characteristics of BMP

BMP的呈味特性因其所處的體系不同而表現(xiàn)出較大的差異性(表1所示)。例如,Spanier等[30]比較了合成的BMP與谷氨酸鈉(monosodium glutamate,MSG)的感官差異,發(fā)現(xiàn)BMP較MSG有更好的鮮味口感和更強(qiáng)的風(fēng)味特性;然而,Van等[25]在合成及商業(yè)BMP中均未檢出文獻(xiàn)報(bào)道的特征鮮味和肉味[21,23,27,31];Hau等[32]將商業(yè)BMP置于純水及NaCl或/和MSG體系中也并未產(chǎn)生鮮味或肉味,而以酸味、收斂味、甜味、咸味和苦味為主。存在這些差異的原因可能是:a.BMP鮮味可能由合成過(guò)程中的雜質(zhì)引起,而這些雜質(zhì)的產(chǎn)生與絲氨酸的副反應(yīng)、混合酸酐偶聯(lián)過(guò)程中的外消旋化作用或斷裂的氨基酸序列有關(guān)[25]。然而這一假設(shè)與從牛肉中分離的BMP具有鮮味[21]的結(jié)論矛盾,因?yàn)樘烊粊?lái)源的BMP由L-氨基酸組成,并未含有上述人工修飾的類似產(chǎn)物;同時(shí),若商業(yè)品與報(bào)道的有鮮味的BMP的合成材料相同[31],那么肽的純度則無(wú)法解釋滋味的差異性。b.組成肽的氨基酸發(fā)生了外消旋化作用,即肽的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性是導(dǎo)致滋味差異的來(lái)源[25]。c.BMP在體系中濃度不同而產(chǎn)生滋味的差異,表1所示,Hau等[32]感官所用濃度均低于前期研究的BMP閾值濃度(1.41 mmol/L)[33];而呈味肽在低于閾值下僅具有滋味增強(qiáng)作用,本身幾乎沒(méi)有或僅含有微弱的風(fēng)味,高于閾值濃度后才表現(xiàn)出滋味特征[33-34],故在亞閾值濃度下沒(méi)有表現(xiàn)出鮮味難以說(shuō)明BMP沒(méi)有風(fēng)味特性。此外,有研究證實(shí)肽的酸味和鮮味有密切關(guān)系[5,35],甚至提出可以把酸味肽看作鮮味肽一部分的結(jié)論[5]。例如Roudot-Algaron等[36]發(fā)現(xiàn)含有Glu的二肽類組分Glu-Asp、Glu-Ala、Glu-Leu等同時(shí)呈現(xiàn)酸味與鮮味的特性。Okumura等人[37]從熟制豬肉中分離到3種酸味肽(Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Glu-Val-His-Glu-Val-Val,Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Glu-Val-His-Glu-Val-Val-Glu和Ala-Pro-Pro-Pro-Pro-Ala-Glu-Val-His-Glu-Val-His-Glu-Glu-[Val-His)能夠增強(qiáng)鮮味和咸味。BMP有六種解離形式,在低pH下,BMP上的三個(gè)羧基可解離出微弱的H+使其呈現(xiàn)輕微酸味,當(dāng)用NaOH調(diào)節(jié)pH到9.5時(shí),Na+和羧基發(fā)生靜電作用而產(chǎn)生咸味[38]?？傊?BMP所處體系不同,滋味存在差異,目前尚無(wú)具體指定的呈味特性。

2 BMP的呈味機(jī)制

BMP在水溶液中呈現(xiàn)的多種味感如鮮味、微弱的甜味和酸味是由于其自身結(jié)構(gòu)與味覺(jué)受體相互作用的結(jié)果。一方面,BMP是由八種氨基酸組成的寡肽,其氨基酸組成、一級(jí)結(jié)構(gòu)是呈味的基礎(chǔ);同時(shí)其結(jié)構(gòu)具有一定的特異性,在口腔中可與不同的味覺(jué)感受器結(jié)合,從而使人感受到不同的滋味特性。

2.1 BMP結(jié)構(gòu)和呈味的關(guān)系

組成BMP的8個(gè)氨基酸(Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala)分別由N-端堿性氨基酸(Lys-Gly),中間部位酸性氨基酸(Asp-Glu-Glu)和C-端疏水性氨基酸(Ser-Leu-Ala)組成,其中Lys-Gly呈現(xiàn)咸味和微鮮味,Asp-Glu-Glu表現(xiàn)出酸味,而Ser-Leu-Ala為苦味(表2所示)。Yamasaki等[31]認(rèn)為,位于BMP C-端附近的苦味可能在酸性氨基酸向N-端延伸時(shí)減弱;另一方面,在這種延伸下,酸味變得強(qiáng)烈,而N端的Lys-Gly的調(diào)節(jié)使其酸味變得柔和;在整個(gè)延伸過(guò)程中,BMP的澀味全部消失,整體呈現(xiàn)出肉的可口滋味。關(guān)于BMP的結(jié)構(gòu)和呈味的關(guān)系,日本廣島大學(xué)曾進(jìn)行系統(tǒng)探究。首先Tamura等[27]研究BMP的一級(jí)結(jié)構(gòu)(構(gòu)成BMP的二肽和三肽,表2所示)和滋味的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)BMP的鮮味由N-端堿性氨基酸和中間部位的酸性氨基酸共同產(chǎn)生。Kuramitsu等[40]進(jìn)一步指出BMP的滋味由N-端堿性氨基酸和中間部位的酸性氨基酸共同形成,而酸性氨基酸明顯影響B(tài)MP的滋味(表2)。此后,Nakata等[39]重新合成BMP及其類似物(表3所示),發(fā)現(xiàn)類似物和BMP具有相似的鮮味,再次證實(shí)上述觀點(diǎn)的同時(shí)提出一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)并不影響B(tài)MP類似物的鮮味或咸味。此外研究發(fā)現(xiàn)在BMP的鈉鹽溶液中,Na+位于N-末端堿性部位、Cl-位于緊鄰Na+的中間酸味部位是產(chǎn)生鮮味/咸味的關(guān)鍵[27,39]。

表2 BMP及其片段混合物的滋味Table 2 Taste of BMP and its fragment mixtures

表3 BMP的類似物在pH=6的鹽溶液的滋味特性Table 3 Taste behavior of BMP analogs neutralized at original pH levels up to 6

綜上,BMP呈現(xiàn)鮮味是其N-端堿性氨基酸(Lys-Gly)和中間部位酸性氨基酸(Asp-Glu-Glu)共同作用的結(jié)果,且酸性氨基酸起主要作用;而在BMP的鹽溶液中,離子攝入量和所處位置會(huì)影響其滋味特性和強(qiáng)度。

另一方面,BMP的結(jié)構(gòu)與目前為止在食品源中發(fā)現(xiàn)的數(shù)十條呈鮮味短肽[19,41]的分子特性具有很好的一致性:a.分子量介于150～3000 u[42-43],其中低于1000 u的鮮味最強(qiáng)[37,44-45];b.氨基酸組成一般都含有Glu和Asp酸性氨基酸殘基中的一種或兩種[35,42,44,46],或者含有一定的親水性氨基酸殘基Tyr、Gly、Thr、Phe等[47-48];c.分子組成中同時(shí)含有帶正電基團(tuán)(堿性氨基酸)、負(fù)電基團(tuán)(酸性氨基酸)以及疏水基團(tuán)[49],且正電基團(tuán)位于負(fù)電基團(tuán)的N-端時(shí)才能產(chǎn)生鮮味[50],同時(shí)N-端氨基酸為Glu時(shí)鮮味更強(qiáng)[45,51]。縱觀BMP自身結(jié)構(gòu)及上世紀(jì)末日本廣島大學(xué)關(guān)于其結(jié)構(gòu)和呈味關(guān)系的探討,發(fā)現(xiàn)均與目前已挖掘的食品源中的鮮味肽三點(diǎn)共性充分吻合,這為BMP呈現(xiàn)鮮味特征提供有力的分子基礎(chǔ)。

2.2 BMP與不同味覺(jué)受體的相互作用

BMP會(huì)產(chǎn)生微弱甜味,Cagan[52]發(fā)現(xiàn)BMP和甜味蛋白monellin亞基Ⅰ的4～10個(gè)氨基酸部位相似(甜蛋白4、5、7、10位和BMP 1、2、4、7位的氨基酸一致,圖1所示),而Spanier[26]和Shim等[53]也發(fā)現(xiàn)鮮味與甜味具有類似的味覺(jué)受體。因此,人感知到BMP的微弱甜味可能來(lái)源于其和味覺(jué)感受器細(xì)胞的monellin結(jié)合位點(diǎn)相互作用所致[52]。

圖1 BMP和甜蛋白結(jié)構(gòu)相似的區(qū)域[52]

BMP在純水中有輕微酸味(表2所示)。研究發(fā)現(xiàn)肽組分中酸性或堿性氨基酸殘基電離出足夠的氫離子可通過(guò)酸敏感離子通道(Acid-sensing ion channels,ASIC)進(jìn)入味蕾細(xì)胞,從而使人感受到肽的酸味[54];通常電離出的陽(yáng)離子H+為定味基,電離出的陰離子A-為助味基。BMP有六種解離形式,在低pH下,BMP上的三個(gè)羧基解離出的微弱H+可刺激口腔酸味受體,從而感受到輕微的酸味。

鮮味作為第五種基本味道被普遍接受主要是鮮味受體的發(fā)現(xiàn)[19]。研究認(rèn)為[55-57],鮮味物質(zhì)分子必須有帶正電分子團(tuán)(AX),帶負(fù)電分子團(tuán)(B)和疏水性分子團(tuán)(X),三種分子團(tuán)分別接到鮮味受體部位[58](G蛋白偶聯(lián)受體家族,taste type 1 receptor 1,T1R1和taste type 1 receptor 3,T1R3)才能感受到鮮味。從BMP的氨基酸殘基來(lái)看,N-端堿性氨基酸Lys-Gly可視為AX,中間三個(gè)酸性氨基酸Asp-Glu-Glu可視為B,而C-端Ser-Leu-Ala可視為X[33],這三個(gè)分子團(tuán)之間的相互作用及與對(duì)應(yīng)鮮味受體部位的結(jié)合,正是BMP具有鮮味的原因[59]。

綜上,BMP之所以能夠產(chǎn)生特征滋味而被味覺(jué)感受器感知到,首先自身結(jié)構(gòu)要滿足一定要求;其次,BMP上具有和味覺(jué)受體相結(jié)合的部位。從上述機(jī)制分析也可得知,BMP不止呈現(xiàn)一種或幾種滋味,而是多種滋味的復(fù)合體,只是在某些特定的環(huán)境條件下某種滋味特征占主導(dǎo)地位。

3 BMP的生物合成

3.1 BMP的生物源性

BMP第一次報(bào)道于牛肉的蛋白水解物中,但它是否存在于天然牛肉中尚無(wú)統(tǒng)一定論。Spanier等[23,26]研究發(fā)現(xiàn)牛肉中BMP可能由內(nèi)源性蛋白酶(主要為組織蛋白酶B或/和L)的作用形成。然而Hau等[32]在天然牛肉提取液中并未檢測(cè)到任何BMP的存在(<1×10-6mg/Kg的檢測(cè)限),同時(shí)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(SwissProt Database)中未檢索到BMP或其前體存在于任何蛋白質(zhì)或肽片段上,這與Spanier等[26]在蛋白質(zhì)和基因數(shù)據(jù)庫(kù)上搜索的結(jié)果一致。但目前為止,大多數(shù)蛋白質(zhì)/肽數(shù)據(jù)庫(kù)是在分子生物學(xué)和相似的研究領(lǐng)域創(chuàng)建的,即它們主要含有某些“生物學(xué)感興趣”但不一定是食品科學(xué)感興趣的化合物。因此“數(shù)據(jù)庫(kù)中未找到”的結(jié)果并不一定意味著“化合物不存在”[32]。BMP是否天然存在尚待進(jìn)一步研究證實(shí),但上述分析也可得知,直接從牛肉中獲取BMP的可能性極低,多技術(shù)合成法是大量生產(chǎn)BMP的必然選擇。

3.2 BMP的制備方法

BMP的制備方法包括化學(xué)合成法、蛋白酶解法和生物工程法。化學(xué)合成法純度高但成本也高,產(chǎn)品可能存在試劑殘留及產(chǎn)量有限等缺陷,研究BMP的滋味特性時(shí)大多使用合成品,但用于生產(chǎn)實(shí)際的可能性較低。蛋白酶解法是目前生產(chǎn)呈味肽的主要方式,BMP第一次報(bào)道是酶解后經(jīng)多步分離、純化的產(chǎn)物[21];目前大多數(shù)的鮮味肽來(lái)源于酶解產(chǎn)物[60],利用商業(yè)酶如中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等作用于蛋白底物,酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾、納濾、色譜等技術(shù)分離純化后經(jīng)質(zhì)譜分析[61-63]。酶解法雖能獲得天然來(lái)源的肽,但水解過(guò)程影響因素較多,獲得的產(chǎn)物也多是肽的混合物,分離純化過(guò)程繁瑣,獲得較高純度的、數(shù)量可觀的肽成本高昂。生物工程法是將BMP基因?qū)氲奖磉_(dá)載體中特異性的表達(dá)并獲取目標(biāo)產(chǎn)物,具有表達(dá)特異性強(qiáng)、易于分離和成本低廉等特點(diǎn),是大量生產(chǎn)BMP的理想方法[33]。

國(guó)外BMP的生物合成有專利報(bào)道。歐洲專利Lerch等[64]將BMP基因連接到有信號(hào)識(shí)別肽序列的載體pNS2上,分別在大腸桿菌、酵母中分泌表達(dá)。美國(guó)專利Bolen等[65]報(bào)道將T蛋白(thaumatin)和M蛋白(monellin)修飾后可以產(chǎn)生新的風(fēng)味蛋白,其中在TII蛋白(T蛋白的一種)中存在一個(gè)風(fēng)味活性區(qū)域(19～26位氨基酸序列),該序列被其他肽段代替后,可以呈現(xiàn)出不同的風(fēng)味特征,當(dāng)這段序列被BMP取代后,蛋白具有牛肉風(fēng)味。國(guó)內(nèi)BMP的生物合成研究以天津科技大學(xué)王艷萍課題組為主,主要探究BMP串聯(lián)基因在畢赤酵母[66]、釀酒酵母[67]中重組表達(dá)、表達(dá)體系的生物學(xué)特征及發(fā)酵優(yōu)化、發(fā)酵液發(fā)生美拉德反應(yīng)制備牛肉香精等方面[28,68-69]。此外,為解決合成及天然來(lái)源的BMP滋味的差異性,張崟等[70-71]將人工構(gòu)建的BMP基因?qū)氪竽c桿菌中成功表達(dá),以期獲得天然來(lái)源的肽從而探究其呈味特性,目前該工作正在推進(jìn)中。

盡管BMP生物合成的理論研究已趨于成熟,但目前其合成和使用尚處于實(shí)驗(yàn)室階段。根據(jù)其結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定、在不同體系中表現(xiàn)出多元的滋味特征,可將BMP與MSG等鮮味劑共同添加到食品中以發(fā)揮協(xié)同增效作用[38],從而降低MSG的使用,符合現(xiàn)代消費(fèi)者追求健康、營(yíng)養(yǎng)、綠色的飲食潮流和觀念。BMP有望作為一種新型的肽類調(diào)味劑具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)潛力。

4 展望

目前,食品中鮮味肽的研究受到越來(lái)越多的重視,而成熟商品化的BMP可以作為更多鮮味肽發(fā)掘和呈味特性研究的基礎(chǔ),從而明晰鮮味肽呈鮮的機(jī)制,推動(dòng)其在食品調(diào)味體系的應(yīng)用。遺憾的是BMP首次報(bào)道后雖引起學(xué)者廣泛關(guān)注并針對(duì)此八肽做了大量探究性工作,但其在呈味特性、呈味機(jī)制、生物源性等方面由于自身結(jié)構(gòu)及所處系統(tǒng)不同而沒(méi)有一致的結(jié)論。因此,關(guān)于BMP的后續(xù)研究除解決上述問(wèn)題外還可從以下幾點(diǎn)入手。第一,雖然BMP與NaCl、MSG有較好的協(xié)同呈味作用[38],但同樣存在不一致的報(bào)道[25,32];而在食品體系中呈味肽一般與其它調(diào)味劑一起使用,因此,有必要深入研究BMP與NaCl、MSG、肌苷酸二鈉(disodium inosinate,IMP)、鳥苷酸二鈉(disodium guanylate,GMP)等常見(jiàn)增味劑的相互作用。第二,基于BMP的穩(wěn)定性,優(yōu)化生物合成法從而大量生產(chǎn)用于食品體系的BMP。第三,目前已發(fā)掘了許多呈味短肽,尤其是鮮味肽[19,20,62],但關(guān)于呈味肽的滋味強(qiáng)度和相對(duì)滋味等評(píng)價(jià)體系尚未建立,因此無(wú)法量化和科學(xué)的評(píng)價(jià)目前已發(fā)掘的呈味肽的呈味特征,在實(shí)際使用時(shí)會(huì)存在盲目性和行業(yè)混亂性等問(wèn)題,可以嘗試以BMP作為呈味肽的典型代表,構(gòu)建呈味肽的評(píng)價(jià)體系,具有很好的開(kāi)拓價(jià)值和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。