張瑞凌，許亦真，劉建萍，李福偉，張沖

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.山東藍(lán)城分析測試有限公司，山東 濟(jì)南 250014)

己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一種非甾體雌激素，能產(chǎn)生與天然雌激素相同的藥理與治療作用，于1938年由Dodds等[1]合成。己烯雌酚廣泛用于婦科病的治療，也作為動(dòng)物促生長劑應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，同時(shí)在水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面也有使用。多年研究證明，己烯雌酚對生物體具有致畸[2]、致癌[3]等危害。歐美等國從20世紀(jì)70年代開始先后頒布禁令，限制己烯雌酚的使用。1979年，世界各國開始嚴(yán)格控制己烯雌酚作為治療藥物使用[4]。2002年，《禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用藥物品種目錄》(農(nóng)業(yè)部公告第176號)中禁止在飼料和動(dòng)物飲用水中使用己烯雌酚及其鹽、酯和制劑[5]，《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》(農(nóng)業(yè)部公告第193號)將其列為食品動(dòng)物禁用獸藥[6]。在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，國內(nèi)仍有將己烯雌酚用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的現(xiàn)象。因此，選取一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法檢測己烯雌酚殘留量，對于水產(chǎn)品的食品安全有重要意義。

目前用于己烯雌酚檢測的方法主要有高效液相色譜法[7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[8]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9]、放射免疫法[10]等。LC-MS/MS法分析結(jié)果準(zhǔn)確，但前處理較為繁瑣，所需儀器設(shè)備使用和維護(hù)費(fèi)用昂貴，且需專業(yè)人員操作，檢測成本高。酶聯(lián)免疫法是我國水產(chǎn)行業(yè)中己烯雌酚檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，具有靈敏度高、操作安全、檢測速度快、儀器成本低等優(yōu)點(diǎn)。酶聯(lián)免疫法會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，對操作人員的技術(shù)水平有一定要求，檢出限也相對較高。本實(shí)驗(yàn)使用酶聯(lián)免疫法對大量實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，選取LC-MS/MS法驗(yàn)證陽性樣品中己烯雌酚的含量，以提高樣品結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀及操作軟件(美國BioTek公司)；氮吹儀(北京普立泰科儀器有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；Agilent 1200 RRLC-6410型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；Agilent 1200液相色譜儀(美國Agilent公司)；Eclipse XDB-C18色譜柱，2.1 mm×150 mm，5 μm(美國Agilent公司)。

1.2 試劑

己烯雌酚ELISA試劑盒(江蘇美正生物科技有限公司)；氯化鈉(上海國藥有限公司)；乙腈(美國Thermo Fisher Scientific)；乙醇(上海國藥有限公司)。

組織樣品為市售魚類，均來源于山東省內(nèi)多地市超市及農(nóng)貿(mào)市場。

1.3 儀器工作參數(shù)

質(zhì)譜使用離子源：ESI，第一級四極桿溫度：100 ℃，第二級四極桿溫度：100 ℃，霧化壓力：206.844 kPa，干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：12 L/min，離子極性：負(fù)，質(zhì)量掃描模式： MRM模式，母離子質(zhì)荷比為267，子離子質(zhì)荷比分別為251和371，碎裂電壓均為140 V，碰撞能量分別為23 V和26 V。

液相色譜條件：以水(A相)和乙腈(B相)為流動(dòng)相進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為300 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。梯度洗脫條件：0～5 min，20%～50% B；5～7 min，50%～95% B；7～8 min，95%～95% B；8～8.01 min，95%～20% B；8.01～12 min，20%～20% B。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

取出樣品肌肉部分，剔除脂肪和結(jié)締組織，切成小塊后混勻，置冰箱中冷凍備用。

樣品解凍后勻漿，準(zhǔn)確稱取1.0 g勻漿后的組織樣本到離心管中，加入1 mL 30%氯化鈉溶液和1 mL乙腈震蕩1 min，再加1 g中性氧化鋁和4 mL乙腈，震蕩5 min后，4000 r/min離心5 min；取上清液2 mL于50 ℃氮?dú)饬飨麓蹈?；加?00 μL無水乙醇，震蕩30 s，再加入900 μL標(biāo)品/樣本稀釋液震蕩混勻后，取上清作為樣本溶液。

2.2 檢測方法

將所需試劑及樣品置于室溫(20～25 ℃)平衡30 min以上；取50 μL標(biāo)準(zhǔn)品/樣本到對應(yīng)的微孔中，然后每孔加入工作濃度酶標(biāo)物50 μL，于25 ℃避光反應(yīng)30 min；將孔內(nèi)液體甩干，每孔加300 μL洗滌液，充分洗滌5次后，拍干；每孔分別加入底物液A液和B液各50 μL，避光于25 ℃反應(yīng)15 min；加入終止液50 μL/孔，用雙波長450 nm/630 nm檢測，在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)。

2.3 靈敏度實(shí)驗(yàn)

分別做6次標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出半抑制濃度(IC50)。分別測定10個(gè)陰性魚肉樣品，測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為檢出限。

2.4 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

在空白樣品中進(jìn)行低、中、高濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行7批檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 靈敏度測定結(jié)果

以計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)溶液相對吸光度值為縱坐標(biāo)，以己烯雌酚0.0、0.1、0.3、0.9、2.7 μg/L濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，分別做6次己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)液相對吸光度值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好，如表1所示。

表1 己烯雌酚測定過程隨行工作曲線及相關(guān)系數(shù)

實(shí)驗(yàn)測得10個(gè)陰性魚肉樣品中己烯雌酚含量分別為0.25、0.27、0.21、0.28、0.15、0.24、0.26、0.17、0.29、0.18 μg/kg，平均值為0.23 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04 μg/kg，則該方法檢出限為0.35 μg/kg。

3.2 準(zhǔn)確度測定結(jié)果

取陰性實(shí)際樣品加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備質(zhì)控樣品，進(jìn)行實(shí)際樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，共進(jìn)行7次加標(biāo)，測得結(jié)果如表2所示。

表2 己烯雌酚加標(biāo)回收率

續(xù)表2

7批陰性樣品在3個(gè)添加濃度的平均回收率在77%～91%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.20%～4.45%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。

3.3 假陰性率

用LC-MS/MS驗(yàn)證隨機(jī)抽取的20份ELISA檢測得到的陰性樣品，均未檢出己烯雌酚殘留，則假陰性率為0，說明本方法具有良好的特異性。

3.4 假陽性率

檢測水產(chǎn)樣品260份，有1個(gè)陽性樣品，測定濃度為1.2 μg/kg。對該樣品用LC-MS/MS驗(yàn)證，質(zhì)譜結(jié)果見圖1。由圖1可以看出該陽性樣品經(jīng)LC-MS/MS測定結(jié)果為陰性。

圖1 己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of standard DES and sample

4 結(jié)論

本文對酶聯(lián)免疫法定量檢測水產(chǎn)品中己烯雌酚的方法進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法中己烯雌酚檢出限為0.35 μg/kg，加標(biāo)回收率為77%～91%，方法滿足農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》[11]的要求。本文采用的LC-MS/MS法避免了假陽性結(jié)果，酶聯(lián)免疫法靈敏、分析快速、操作簡單、檢測效率高，適合大批量樣品中己烯雌酚殘留的篩查。