薛志峰 ，張 兵 ，陳 靜 ，吳玉梅 ，盧 鵬 ，張永苗 ，祁東利 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術(shù)教育部工程中心，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，天津 301617）

白內(nèi)障是一種由于晶狀體損傷和蛋白質(zhì)變性引起的晶狀體退化從而影響患者視力的疾病，并已成為全球失明的主要原因[1-2]。然而，除手術(shù)干預(yù)外，目前沒有有效的白內(nèi)障治療方法[3]。紫外線B的照射、年齡的增加、肥胖、糖尿病、吸煙和高血壓等都是白內(nèi)障的發(fā)病因素[4-5]。研究表明，紫外線B照射是白內(nèi)障的重要誘發(fā)因素[6]，紫外線B進入眼睛后，通過光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生活性氧（ROS），然后對細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用[7-9]。隨著一些抗氧化劑（還原酶，抗壞血酸和還原型谷胱甘肽）的減少，細胞膜和其他生理結(jié)構(gòu)（一些晶狀體間隙連接蛋白：Cx43，Cx46和Cx50）被氧化和破壞[8-9]。此外，紫外線B照射會誘導(dǎo)促凋亡的Bax基因，并在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上抑制抗凋亡的Bcl-2基因。紫外線B照射在人晶狀體上皮細胞（HLEC）中的同時，觀察到線粒體功能障礙的快速喪失，然后促進HLEC的凋亡，最終導(dǎo)致白內(nèi)障的形成。因此局部給予抗氧化劑可以避免氧化應(yīng)激反應(yīng)并治療白內(nèi)障。已有研究表明熊去氧膽酸和咖啡因這樣具有抗氧化作用的藥物可以用于治療氧化性白內(nèi)障[10]。

松果菊苷（Echinacoside）是一種從肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干莖中分離出的一種苯乙醇苷（見圖1），其具有很強的抗氧化活性，可以顯著降低氧化應(yīng)激作用。研究表明，松果菊苷可以提高超氧化物歧化酶的活性，降低活性氧從而緩解被紫外線B照射引起的皮膚損傷，還可以起到改善血管性癡呆型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和對急性肝損傷大鼠的保護作用[11-13]。因此，松果菊苷理論上可用于治療氧化性白內(nèi)障疾病。

目前，液體滴眼劑和軟膏是最主要的眼科制劑形式，然而其較低的生物利用度限制了它們的應(yīng)用[14-16]。固體脂質(zhì)納米粒（SLN）在納米藥物載體中起重要作用，可用于治療眼部疾病。它可以將藥物吸附或包裹于類脂核中制成的粒徑為10～1 000 nm的納米給藥系統(tǒng)，具有可控制藥物釋放、避免藥物泄漏或降解以及良好的靶向性等優(yōu)點[17-19]。本研究根據(jù)本實驗室前期優(yōu)化的處方制備了ECH-SLN[20]，運用DSC和XRD表征ECH-SLN的物理性質(zhì)，并利用人角膜上皮HCEpiC細胞和人晶狀體上皮SRA01/04細胞對SLN的體外細胞攝取情況進行評價。為證明SLN能夠有效地將松果菊苷遞送到眼細胞中，進而為發(fā)揮抗氧化活性來治療白內(nèi)障的可行性。

圖1 松果菊苷化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1 儀器 CoMetro高效液相色譜系統(tǒng)（CoMetro，美國），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore，美國），AX205電子天平（Mettler toledo，瑞士），JD-16A 精密恒溫水浴槽（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司），F(xiàn)DU-2100冷凍干燥機（日本東京理化有限公司），Nano-ZS激光粒徑測定儀（英國馬爾文公司），差示掃描量熱儀（Jade DSC，美國），X射線衍射儀（Rigaku D/max 2500 v/pc，日本），RW200S25電動攪拌（IKA 德國），超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher，美國），BDS200倒置顯微鏡（奧特光學(xué)，中國），高速冷凍離心機（Thermo，美國），多功能酶標儀（Perkin Elmer，美國），Ti-U 倒置熒光顯微鏡（Nikon，日本），Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（Perkin Elmer儀器有限公司）。

1.2 藥品及試劑 松果菊苷對照品（天津中新藥業(yè)，批號 82854-37-3，含量＞98%），卵磷脂（Lipoid，美國），Myrj52（遼陽奧克納米材料有限公司），超濾離心管（10kDa，美國Millipore公司），DMEM/F12、MEM培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（PAA），雙抗（Invitrogen），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），羅丹明123（90%，Solarbio，北京索萊寶科技有限公司），多聚甲醛（PFA）（天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 ECH-SLN的制備 精密稱取處方量Myrj52加入超純水8 mL，75℃水浴中磁力攪拌溶解，作為水相。精密稱定處方量松果菊苷、卵磷脂于適量無水乙醇，再稱取70 mg單硬脂酸甘油酯加熱溶解構(gòu)成有機相。75℃水浴中，將有機相緩慢注入攪拌的水相中，繼續(xù)攪拌有機相揮發(fā)至原體積的1/4時，將剩余藥液經(jīng)微孔濾膜過濾，4℃固化2 h，即得ECHSLN 混懸液[26]。

2.2 ECH-SLN的粒徑和Zeta電位測定 取“2.1”項下制備得到的ECH-SLN適量，用去離子水稀釋至適當濃度，室溫下用激光粒徑測定儀分別測定ECH-SLN的粒徑及Zeta電位。結(jié)果顯示，其粒徑為（79.15±0.76）nm，多分散指數(shù)（PDI）為（0.25±0.01）；Zeta電位為（-20.27±2.39）mV。

2.3 差示掃描量熱（DSC）研究 精密稱取松果菊苷對照品、空白SLN凍干粉、ECH-SLN凍干粉、物理混合物（空白 SLN：松果菊苷=5∶1）樣品各 7 mg，利用DSC進行分析，以空鋁鉗鍋為參比，另一鋁鉗鍋分別放入以上4種樣品，升溫速率為10℃/min，掃描范圍為30～270℃，氮氣流速為50 mL/min，DSC曲線圖，見圖2。

圖2DSC圖譜

結(jié)果顯示，松果菊苷和物理混合物在150℃下顯示出松果菊苷的熔化吸熱特征峰，而該峰在空白SLN和ECH-SLN中消失?？瞻譙LN，ECH-SLN和物理混合物在110℃和230℃下顯示出兩個熔化的吸熱峰，而該峰在松果菊苷中并未出現(xiàn)。表明松果菊苷是以分子分散形式被包裹在SLN中。

2.4 X射線衍射（XRD）研究 精密稱取松果菊苷對照品、空白SLN凍干粉、ECH-SLN凍干粉、物理混合物（空白 SLN∶松果菊苷=5∶1）樣品約 5 mg，分別用XRD測定，條件及參數(shù)如下：使用Ni-濾波器，Cu-Ka射線，波長為 1.540 56 ?，40 kV 電壓和200 mA 電流。在 5～90°的 2θ范圍，以 2°/min的速率進行掃描，結(jié)果見圖3。

圖3 樣品XRD圖譜

XRD結(jié)果顯示，松果菊苷和物理混合物在20°時表現(xiàn)出明顯的松果菊苷峰值，而在空白SLN和ECH-SLN中該峰值降低?？瞻譙LN，ECH-SLN和物理混合物在20°～25°范圍內(nèi)顯示SLN范圍特征峰，而該峰在松果菊苷中并未出現(xiàn)。結(jié)果表明松果菊苷存在于SLN是以分子分散形式而不是游離形式，與DSC的結(jié)論一致。

2.5 體外細胞攝取研究

2.5.1 細胞的培養(yǎng) 將人角膜上皮HCEpiC細胞懸液置于離心管中，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基（胎牛血清終濃度為10%，雙抗終濃度為1%），1000r/min離心3 min，棄去上清液，再次加入完全培養(yǎng)基，輕輕吹勻細胞，以1×104個/mL密度接種至培養(yǎng)瓶，置入5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d后更換培養(yǎng)液，每4 d傳代1次。SRA 01/04加入MEM/EBSS完全培養(yǎng)基（胎牛血清終濃度為10%，雙抗和Hepes終濃度均為1%）重復(fù)上述操作，進行傳代、培養(yǎng)。

2.5.2 細胞毒性研究 將Rh 123作為熒光探針，并按照ECH-SLN的制備方法制備Rh 123-SLN。采用細胞增殖-毒性檢測試劑盒（CCK-8）評價不同濃度的游離Rh 123和Rh 123-SLN對HCEpiC細胞和SRA01/04細胞的細胞毒性。取正常生長的消化、混懸后的HCEpiC細胞和SRA01/04細胞消化、混懸，分別以1×104個/mL的密度接種至96孔板，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h至細胞貼壁80%融合，棄掉DMEM/F12完全培養(yǎng)基及MEM/EBSS完全培養(yǎng)基，PBS液漂洗兩次，HCEpiC細胞和SRA01/04細胞再分別加入DMEM/F12、MEM/EBSS同步化24 h。之后將100 μL空白培養(yǎng)基及不同濃度樣品（Rh 123、Rh 123-SLN）加入到孔中，設(shè)平行孔每組為6。37℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，細胞用PBS液洗滌3次，每孔中分別加入終濃度為10%的CCK-8溶液，37℃孵育1 h，多標記酶標儀在450 nm波長處測定其光密度（OD）值。

經(jīng)測定，空白孔的OD值并記錄為A空白，對照孔的OD值記錄為A對照，含有Rh123和Rh123-SLN的給藥孔的OD值并記錄為A測定。根據(jù)公式（2）計算細胞活力（%）。根據(jù)結(jié)果選擇適當濃度的Rh 123和Rh 123-SLN用于進一步的細胞攝取研究。

細胞活力（%）=（A測定-A空白）/（A對照-A空白）×100%（2）

Rh 123和Rh 123-SLN對HCEpiC細胞和SRA 01/04細胞活力的影響結(jié)果如圖4、5，在5.13 μg/mL和10.25 μg/mL濃度下Rh 123和Rh 123-SLN對兩種細胞均無明顯毒性，與對照組相比無顯著性差異。當 Rh 123 的濃度為 20.50 μg/mL 和 41.00 μg/mL時，對兩種細胞均產(chǎn)生顯著毒性。因此，選擇濃度為5.13 μg/mL 和 10.25 μg/mL 的 Rh 123-SLN 進行細胞攝取研究。

圖4 Rh 123和Rh 123-SLN對HCEpiC細胞活力的影響

圖5 Rh 123和Rh 123-SLN對SRA 01/04細胞活力的影響

2.5.3 細胞攝取研究 取正常生長的HCEpiC細胞與SRA 01/04細胞消化、混懸，將HCEpiC細胞以2×104/孔、SRA 01/04 細胞以 1×104/孔的密度分別接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2下培養(yǎng)24 h使細胞貼壁生長。經(jīng)同步化后，分別將100 μL濃度為 5.13 μg/mL 和 10.25 μg/mL 的 Rh 123 和 Rh123-SLN樣品加入到不同孔中。37℃下培養(yǎng)4 h和8 h后，棄去含樣品的培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌3次，采用Hoechst33342對細胞核進行染色，PBS洗滌后用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)拍照成像，使用Columbus圖像數(shù)據(jù)處理和分析系統(tǒng)來處理實驗數(shù)據(jù)和圖像，結(jié)果見圖6、7。

結(jié)果表明，隨著Rh 123-SLN孵育時間從4 h延長至 8 h，濃度從 5.13 μg/mL 增加至 10.25 μg/mL，HCEpiC細胞和SRA01/04中的綠色熒光強度增強。如圖6、7所示，圖C、D中的熒光強度均強于圖A、B中的熒光強度，表明隨著Rh-123濃度的增加，細胞中的熒光強度也增加。圖B和圖D中的熒光強度分別強于圖A、C中的熒光強度，表明細胞中的熒光強度隨孵育時間的延長而增加。圖7表明，綠色熒光主要分布在細胞核周圍，即Rh 123-SLN被SRA01/04細胞攝取后主要存在于細胞質(zhì)中。表明Rh 123-SLN可以被HCEpiC細胞和SRA01/04細胞吸收，且細胞攝取量與藥物濃度和孵育時間呈正相關(guān)。

圖 7 5.13 μg/mL（A）和 10.25 μg/mL（C）Rh 123-SLN 共培養(yǎng) 4 h 后，以及 5.13 μg/mL（B）和 10.25 μg/mL（D）的 Rh 123-SLN共培養(yǎng)8 h后SRA01/04細胞的高內(nèi)涵圖像

圖 6 5.13 μg/mL（A）和 10.25 μg/mL（C）Rh 123-SLN 共培養(yǎng) 4 h 后，以及 5.13 μg/mL（B）和 10.25 μg/mL（D）的 Rh 123-SLN共培養(yǎng)8 h后HCEpiC細胞的高內(nèi)涵圖像

3 討論

DSC是醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域中最廣泛使用的熱力學(xué)方法之一。通過測量程序升溫期間藥物焓和溫度的變化，可以研究藥物的純度，轉(zhuǎn)化熱，反應(yīng)熱和無定形狀態(tài)等[21-22]。該研究通過DSC分別對ECH、空白SLN、ECH-SLN及物理混合物的吸熱峰進行研究表征及比較分析，證明了松果菊苷在SLN中以分子分散狀態(tài)存在。XRD是一種晶體檢測方法。通過XRD衍射圖譜，可以獲得材料的成分、材料內(nèi)部原子或分子的結(jié)構(gòu)或形態(tài)，在制藥工業(yè)中，主要用于確定晶體的原子和分子結(jié)構(gòu)來判斷晶體類型和組成。該研究通過XRD分析，松果菊苷在SLN中是以分子分散形式而不是晶體形式。DSC和XRD兩種物理表征方式確定了松果菊苷在SLN中的存在形式。

松果菊苷為水溶性藥物，本研究中應(yīng)選擇水溶性的熒光標記物來替代松果菊苷制備熒光標記的SLN，而Rh 123能溶于水及乙醇，溶解性與松果菊苷較為相似，且無毒性，不會損傷細胞，并且它可以通過細胞膜的選擇性染色活細胞線粒體而呈黃綠色熒光，Rh 123熒光標記物單獨對細胞作用時不能進入細胞，故采用Rh 123包載的SLN能通過熒光以證明細胞對SLN的攝取情況，因此選擇Rh 123為熒光標記物進行細胞攝取研究。研究表明，以Rh 123溶液為熒光標記物標記HCEpiC細胞和SRA 01/04細胞，并用Hoechst 33342對細胞核染色。表明10.25 μg/mL的Rh 123溶液與人晶狀體上皮HCEpiC細胞或人角膜上皮SRA 01/04細胞共孵育8 h后，均未見明顯綠色熒光。初步判斷Rh 123溶液在實驗孵育時間內(nèi)不能進入兩種細胞或進入細胞量很少不能被觀測到，故排除了熒光標記物Rh 123自身對Rh 123-SLN攝取的影響。

本研究制備的ECH-SLN拓展了松果菊苷抗氧化活性的應(yīng)用及松果菊苷在白內(nèi)障治療中的潛在作用，并驗證了SLN在眼部給藥系統(tǒng)中的有效性。雖然證實了Rh 123-SLN可被HCEpiC和SRA01/04細胞攝取，及以SLN為載體時，松果菊苷可順利進入細胞，但松果菊苷進入細胞后的抗氧化活性作用的機制及效果需進一步研究。