毛 睿，劉亞男 ，李麗紅，田 盼，王 迎，竇志英，王 飄

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

麻黃為麻黃科植物草麻黃（Ephedra sinica Stapf）中麻黃（Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.）或木賊麻黃（Ephedra equisetina Bye.）的干燥草質(zhì)莖，是一種常用中藥，其性溫，味辛、微苦，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫的功能[1]。首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主中風(fēng)，傷寒頭痛，溫瘧，發(fā)表出汗，去邪熱氣，止咳逆上氣，除寒熱，破癥堅(jiān)積聚。”[2-3]麻黃的化學(xué)成分復(fù)雜，含有生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酚酸、糖類及鞣質(zhì)、單萜糖苷類、木脂素類等多種化學(xué)成分[4-5]，藥理作用豐富[6-7]。2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）規(guī)定以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不得少于0.80%作為麻黃質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，而麻黃有諸多功效，且其量有限，導(dǎo)致市場(chǎng)混亂。

本研究共收集31個(gè)批次的麻黃飲片，依照《中國(guó)藥典》進(jìn)行浸出物、灰分、水分檢測(cè)；采用HPLC測(cè)定31批麻黃飲片中麻黃堿和偽麻黃堿的含量；運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)，即利用計(jì)算機(jī)系統(tǒng)和相應(yīng)的程序分析采集到的藥材及飲片的總成分提取物的光譜、色譜數(shù)據(jù)以及某些經(jīng)量化后的指標(biāo)，獲取用于中藥材分析鑒別的有用信息，運(yùn)用計(jì)算機(jī)代替人力對(duì)中藥材進(jìn)行分類和鑒別真?zhèn)?。近年?lái)CA、PCA及PLS-DA已廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)[8-11]。建立兩種無(wú)監(jiān)督的化學(xué)模式識(shí)別方法：CA、PCA以及一種有監(jiān)督的化學(xué)模式識(shí)別方法PLS-DA對(duì)麻黃飲片質(zhì)量進(jìn)行整體分析，初步闡述了麻黃飲片的質(zhì)量等級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)臨床安全用藥及制劑、調(diào)劑都具有重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 HPLC高效（島津LC-2010AHT，LC solution工作站），超聲波清洗器KQ-250E（昆山市超聲洗器有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司），F(xiàn)A2004電子分析天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)W100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 采集中國(guó)31個(gè)不同廠家批次的麻黃飲片，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李天祥教授鑒定均為麻黃科植物草麻黃Ephdra sinica Stapf.的干燥草質(zhì)莖，詳見表1。乙腈為色譜純（SIGMAALORICH），水為娃哈哈純凈水，磷酸及三乙胺購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷公司，麻黃堿對(duì)照品（No.171241-201508）、偽麻黃堿對(duì)照品（No.171237-2015010）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 含水量、總灰分及水溶性浸出物的含量測(cè)定按2015年版《中國(guó)藥典》通則0832項(xiàng)下水分測(cè)定中烘干法、通則2201項(xiàng)下冷浸法中水溶性浸出物測(cè)定法、通則2302項(xiàng)下總灰分測(cè)定法測(cè)定。31批麻黃飲片含水量范圍為2.36%～5.33%；浸出物含量范圍 13.05%～28.11%；灰分含量范圍為 5.84%～8.94%，均符合2015年版《中國(guó)藥典》的要求。

表1 實(shí)驗(yàn)麻黃飲片

2.2 麻黃堿與偽麻黃堿含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜條件的選擇，對(duì)《中國(guó)藥典》2015年版1部的規(guī)定中麻黃藥材的色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，文獻(xiàn)記錄研究者采用乙腈∶0.1%磷酸水溶液（3∶97）為流動(dòng)相，測(cè)定麻黃堿與偽麻黃堿，分離度良好。通過(guò)實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相中加入0.1%的三乙胺，可以將麻黃堿、偽麻黃堿完全分離，且分離度良好。本實(shí)驗(yàn)采用色譜條件如下：色譜柱：Kromasil C18柱250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液（0.1%三乙胺）（A）-乙腈（B）=96∶4，等度洗脫，流速：1 mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，進(jìn)樣量10 μL。麻黃藥材及標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖見圖1，分離效果很好。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品適量于100mL容量瓶，加甲醇制得麻黃堿42 μg/mL、偽麻黃堿38 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品細(xì)粉約0.5000g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率600 W，頻率50 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用 1.44%磷酸溶液補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系 分別精密移取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋一系列濃度的對(duì)照品溶液，鹽酸麻黃堿的濃度分別為，鹽酸偽麻黃堿的濃度分別為，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，鹽酸麻黃堿的線性方程為Y=530 3761.71X-4684445.67，線性范圍在 50～1210μg/mL，r=0.9999；鹽酸偽麻黃堿的線性方程為Y=16 169 601.74X+104 113 9.70，線性范圍在 40～960 μg/mL，r=0.999 9。

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下混標(biāo)溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄麻黃堿與偽麻黃堿的峰面積并計(jì)算RSD值。麻黃堿、偽麻黃堿RSD值分別為0.29%、0.62%。表明儀器精密度良好。

圖1 麻黃藥材（A）和標(biāo)準(zhǔn)品（B）HPLC色譜圖

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件在 0、2、4、8、12h 分別進(jìn)樣，進(jìn)樣 10μL，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。麻黃堿與偽麻黃堿RSD值分別為2.14%，1.87%。表明樣品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一個(gè)樣品6份，按“2.2.3”提取處理方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算各對(duì)照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示麻黃堿與偽麻黃堿RSD值分別為2.17%、2.15%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的麻黃飲片粉末9份，每份0.25 g，按照表加入對(duì)照品溶液。按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見表2。

2.3.6 將31批樣品按“2.3.3”提取處理方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

2.4 數(shù)據(jù)分析

2.4.1 無(wú)監(jiān)督化學(xué)模式識(shí)別 運(yùn)用SPSS 19.0軟件對(duì)31批麻黃飲片進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。本研究以其水分、灰分、浸出物、麻黃堿含量、偽麻黃堿含量和總含量為指標(biāo)，采用組間連接法，利用歐式距離作為樣品的測(cè)度，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。本次系統(tǒng)聚類分析可分為兩大類：S12、S13、S14、S15、S6、S30、S31分為一類，剩余為另一類，與PCA、PLS-DA 分類一致，且 S12、S13、S14、S15、S6、S30、S31麻黃飲片質(zhì)量均一，麻黃堿、偽麻黃堿總含量較高。

表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將31批麻黃飲片的水分、灰分、浸出物、麻黃堿含量、偽麻黃堿含量和兩者總含量為分析變量，導(dǎo)入SIMCA-P 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，主成份分析法作為數(shù)據(jù)挖掘的一種方法，將高維空間的問(wèn)題轉(zhuǎn)化到低維空間處理，在不損失或較少損失原有指標(biāo)信息特征的情況下，將多個(gè)具有相關(guān)性的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個(gè)相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)（即主成分），從而使繁多的求解目標(biāo)簡(jiǎn)化[12]，見圖2。采用主成份分析來(lái)描述生麻黃飲片質(zhì)量的分布情況，根據(jù)特征值獲取的結(jié)果兩個(gè)主成份的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到了98.0%，其中PC1（即麻黃堿與偽麻黃堿總含量）貢獻(xiàn)率達(dá)到了71.2%，為分類中的關(guān)鍵因素，能反映大部分質(zhì)量信息。交叉驗(yàn)證系數(shù)為0.766，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)能力合理，見圖3。主成份分析分析結(jié)果表明，麻黃飲片可分為兩類。

主成份分析與聚類分析過(guò)程中能自動(dòng)生成各主成份的權(quán)重，在很大程度上避免了人為因素在評(píng)價(jià)過(guò)程中的干擾；主成份分析能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，對(duì)提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行客觀充分的多元分析，因此兩者能較好地保證評(píng)價(jià)結(jié)果的客觀性。

2.4.2 有監(jiān)督化學(xué)模式識(shí)別 偏最小二乘法判別分析，是判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法。判別分析是一種根據(jù)觀察或測(cè)量到的若干變量值，來(lái)判斷研究對(duì)象如何分類的常用統(tǒng)計(jì)分析方法。其原理是對(duì)不同處理樣本（如觀測(cè)樣本、對(duì)照樣本）的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并檢驗(yàn)訓(xùn)練集的可信度。本研究將31批麻黃飲片的水分、灰分、浸出物、麻黃堿含量、偽麻黃堿含量和兩者總含量為分析變量，導(dǎo)入SIMCA-P 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行偏最小二乘回歸的計(jì)算，建立有監(jiān)督的模式識(shí)別模型偏最小二乘法判別分析，根據(jù)軟件自動(dòng)擬合31批麻黃飲片的質(zhì)量信息，將31批麻黃飲片分為兩類，可驗(yàn)證主成份分析結(jié)果，得散點(diǎn)圖4，本實(shí)驗(yàn)所擬合的模型解釋能力參數(shù)R2X=0.705，R2Y=0.809，預(yù)測(cè)能力參數(shù)Q=0.788，表示所建模型穩(wěn)定、合理。故由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將麻黃飲片分為兩個(gè)等級(jí)。

表3 31批麻黃飲片中麻黃堿與偽麻黃堿浸出物、水分、總灰分、麻黃堿、偽麻黃堿含量測(cè)定結(jié)果（n=6）%

3 討論與結(jié)論

圖2 31批麻黃飲片聚類圖

圖3 31批麻黃飲片主成份分析分結(jié)

圖4 31批麻黃飲片偏最小二乘法回歸分析結(jié)果

本研究共收集了31批麻黃飲片，建立優(yōu)化的HPLC含量測(cè)定條件，增加水溶性浸出物作為檢測(cè)指標(biāo)，并依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》進(jìn)行了水分、灰分以及水溶性浸出物含量測(cè)定，初步評(píng)價(jià)了麻黃飲片的質(zhì)量。但目前《中國(guó)藥典》僅規(guī)定了藥材的合格標(biāo)準(zhǔn)，而優(yōu)質(zhì)的中藥飲片是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中成藥的必要條件，因此，制定藥材的等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。研究采用兩種無(wú)監(jiān)督的化學(xué)模式識(shí)別模型將麻黃飲片分為兩類，由主成份分析給出麻黃堿與偽麻黃堿總含量為優(yōu)質(zhì)分類的關(guān)鍵因素，且水分、灰分、浸出物受人為影響較大，故本實(shí)驗(yàn)以麻黃堿與偽麻黃堿的總含量為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將31批麻黃飲片分為兩個(gè)等級(jí)，優(yōu)等：麻黃堿及偽麻黃堿總含量≥2.6%；統(tǒng)貨：麻黃堿及偽麻黃堿總含量在0.8%～2.6%。并利用偏最小二乘法判別分析進(jìn)一步驗(yàn)證，以科學(xué)、客觀的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，取代以往僅憑外觀、經(jīng)驗(yàn)等主觀的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，對(duì)于有效監(jiān)控飲片質(zhì)量具有現(xiàn)實(shí)意義[13]。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)麻黃中草麻黃的麻黃飲片進(jìn)行了研究，擬定的各項(xiàng)指標(biāo)限量在蜜炙麻黃以及木賊麻黃和中麻黃中有待進(jìn)一步研究。