與α-烯醇化酶相關(guān)的ELISA方法的建立及在肝纖維化檢測(cè)中的應(yīng)用探索

王 波，楊婷婷，李 志

(大連市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧大連 116033)

肝纖維化是由各種致病因子所致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生按嚴(yán)重程度，分為早期階段(肝纖維化期階段)和晚期階段(肝硬化期)，肝硬化是由各種因素導(dǎo)致慢性肝損害的一類晚期肝纖維化疾病[1]。肝纖維化期是可逆階段，如果能早期診斷并給予抗纖維化治療，肝臟功能可能恢復(fù)到正?；蚪咏顟B(tài)，可預(yù)防肝硬化的發(fā)生[2]。α-烯醇化酶是一種可以在肝纖維化患者體內(nèi)誘發(fā)自身免疫應(yīng)答的自身抗原，通過(guò)原癌基因c-myc的抑制作用來(lái)調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)和分化[3]。國(guó)外有研究證實(shí)抗α-烯醇化酶的自身抗體在肝纖維化期階段患者的血清中出現(xiàn)頻率相當(dāng)高，可以作為一種潛在的預(yù)測(cè)因子[4]。本研究通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲取人α-烯醇化酶，建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)反應(yīng)模式檢測(cè)肝纖維化期和肝硬化患者及健康者血清中抗α-烯醇化酶的自身抗體，評(píng)價(jià)α-烯醇化酶對(duì)肝纖維化的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集處于肝纖維化期階段(0～3期)的患者35例，肝硬化患者48例，肝纖維化的組織病理學(xué)分期采用METAVIR評(píng)分系統(tǒng)；另選取本院體檢健康者60例作為健康對(duì)照組，無(wú)免疫性及明顯的肝炎疾病證據(jù)。對(duì)照組與患者組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2菌株與試劑 克隆載體pEASY-T1 Simple Cloning Vector、表達(dá)感受態(tài)菌BL21(DE3) 等購(gòu)于北京全式金生物公司；ENO1 cDNA，ENO1抗體購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Mastermix購(gòu)于北京天根生化科技有限公司；凝膠成像儀為UVPINC公司產(chǎn)品；包被液、酶標(biāo)抗人Ig-G為惠民生物技術(shù)公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1ENO1基因的克隆及表達(dá) 根據(jù)GenBank中ENO1的cDNA基因序列，設(shè)計(jì)其中的ENO1基因特異性引物，上、下游引物分別為P1：5′-CGG ATC CAT GTC TAT TCT CAA GAT CCA TGC C-3′，P2：5′-CAA GCT TTT ACT TGG CCA AGG GG-3′；PCR擴(kuò)增目的基因ENO1；目的片段回收后與克隆載體pEASY-T1連接，轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于Amp/LB平板上，篩選陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒。將測(cè)序正確的克隆質(zhì)粒和pET32a(+)表達(dá)質(zhì)粒分別經(jīng)BamHI/HindⅢ雙酶切，切膠回收目的片段，T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接后轉(zhuǎn)化至Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞，于Amp/LB平板上挑取單個(gè)克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定；將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)菌株BL21(DE3)中，經(jīng)篩選和增菌后用微生物總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物，回收純化重組蛋白并定量分析，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2ELISA方法的建立 利用方陣滴定法確定抗原包被濃度、血清稀釋度和作用時(shí)間等反應(yīng)參數(shù)，陽(yáng)性反應(yīng)的cut-off值是健康混合血清加3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的平均光密度值，最終確定包被抗原濃度為5 μg/mL，血清稀釋度為1∶50時(shí)，P/N相差較大為最佳稀釋濃度。

1.3.3用所建立的ELISA 方法進(jìn)行標(biāo)本的檢測(cè) (1)包被抗原：用磷酸鹽緩沖液PBS稀釋ENO1抗原(原濃度為230 μg/mL)濃度至5 μg/mL，100微升/孔，4 ℃過(guò)夜，洗液(PBS+0.05%吐溫20)沖洗3次；(2)封閉：封閉液(PBS+1%BSA+0.1%吐溫20)室溫封閉2 h，洗板3次；(3)加待測(cè)抗體：將肝纖維化早期患者、肝硬化期患者及健康對(duì)照組血清分別稀釋后加入封閉后的酶標(biāo)板100微升/孔，每孔設(shè)置平行對(duì)照；(4)加二抗：每孔加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗人Ig-G 100 μL,水浴40 min；(5)每孔加終止液TMB 100 μL終止反應(yīng)，水浴顯色15 min后測(cè)定OD值。

1.4應(yīng)用免疫印跡法分析驗(yàn)證ELISA 對(duì)肝纖維化期血清標(biāo)本的抗α-烯醇化酶的自身抗體進(jìn)行免疫印跡分析，對(duì)免疫印跡結(jié)果和ELISA結(jié)果進(jìn)行分析，驗(yàn)證2種方法陽(yáng)性檢出率是否相等。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS19.0系統(tǒng)，陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ENO1基因的克隆及表達(dá) 通過(guò)PCR擴(kuò)增目的基因ENO1，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為 1 300 bp，與預(yù)期結(jié)果相符(見圖1)。重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/ENO1經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，蛋白主要以可溶性上清形式存在，純化后電泳顯示為單一蛋白條帶：蛋白ENO1理論值47×103(連接pET-32a載體包含硫氧還蛋白Trx和HIS-tag標(biāo)簽約20×103，故重組蛋白67×103左右)，見圖2。

注：M為DNA marker，1為ENO1基因擴(kuò)增片段

圖1ENO1基因PCR產(chǎn)物電泳圖

注：M為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，1為純化后ENO1

圖2純化蛋白SDS電泳圖

2.2臨床標(biāo)本的檢測(cè) 用所建立的ELISA方法檢測(cè)肝纖維化期患者、肝硬化期患者及健康對(duì)照組血清中抗α-烯醇化酶自身抗體，結(jié)果顯示在肝纖維化期和肝硬化期患者中，抗α-烯醇化酶自身抗體的陽(yáng)性率高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.74,P<0.05)，且在肝纖維化期患者中也顯著高于肝硬化期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.27,P<0.05)，見表1。

表1 各組外周血中抗α-烯醇化酶自身抗體結(jié)果

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與肝硬化組比較，▲P<0.05

2.3免疫印跡法分析驗(yàn)證ELISA結(jié)果 對(duì)35例肝纖維化期患者血清α-烯醇化酶進(jìn)行免疫印跡分析，證實(shí)了酶聯(lián)免疫法和免疫印跡法2種檢測(cè)方法檢出率的一致性(χ2=0.33,P>0.05)，在酶聯(lián)免疫方法中抗α-烯醇化酶陽(yáng)性的血清在免疫印跡法中也可得到證實(shí)，見表2。

表2 ELISA和免疫印跡法陽(yáng)性率驗(yàn)證結(jié)果(n)

3 討 論

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理學(xué)過(guò)程，普遍認(rèn)為肝纖維化的過(guò)程是可逆的，適當(dāng)有效的治療不僅可減緩其向肝硬化的發(fā)展，甚至可減輕已有的肝纖維化程度[5]。因此阻止病情進(jìn)展到肝硬化期，這有賴于對(duì)肝纖維化期階段的預(yù)測(cè)和診斷[6-7]。

α-烯醇化酶是一種可以在肝纖維化患者體內(nèi)誘發(fā)自身免疫應(yīng)答的自身抗原，也是肝纖維化診斷的一種潛在的預(yù)測(cè)因素[4]。本研究表明可以通過(guò)原核表達(dá)技術(shù)獲取人源化的α-烯醇化酶，該蛋白是一種穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)，以此作為抗原，建立血清學(xué)診斷模式，用所建立的ELISA方法檢測(cè)肝纖維化期患者、肝硬化期患者及健康對(duì)照組血清中抗α-烯醇化酶自身抗體，結(jié)果顯示在肝纖維化期和肝硬化期患者血清中，抗α-烯醇化酶自身抗體的陽(yáng)性率高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且在纖維化期患者中也顯著高于肝硬化期患者(P<0.05)。有研究表明，在自身免疫性肝炎的患者血清中抗α-烯醇化酶抗體的陽(yáng)性率(50%～60%)，高于原發(fā)性膽汁性肝硬化(30%)和肝癌(14.3%)[4,8]?？梢钥闯?，隨著肝臟疾病的進(jìn)展，抗α-烯醇化酶抗體水平呈降低的趨勢(shì)，盡管現(xiàn)在缺少這種抗α-烯醇化酶抗體從良性肝臟疾病到末期疾病過(guò)程中水平變化的全面研究，但是檢測(cè)抗α-烯醇化酶抗體水平從肝纖維前期到肝硬化再到肝癌的變化表明抗α-烯醇化酶抗體的出現(xiàn)或許是肝臟疾病診斷的預(yù)示性標(biāo)志物，也可以作為肝纖維化期的生物標(biāo)志物。

盡管抗α-烯醇化酶抗體在肝纖維化形成過(guò)程中的發(fā)揮機(jī)制還不清楚，但有研究報(bào)道這種酶可以使纖維蛋白溶酶原結(jié)合在細(xì)胞表面，也可促使單核細(xì)胞在急性肺損傷時(shí)移向炎癥區(qū)域[9]。此外，據(jù)報(bào)道α-烯醇化酶可以被JNK信號(hào)(在纖維化中起積極作用)途徑調(diào)控[7]。因此α-烯醇化酶在促進(jìn)免疫細(xì)胞趨向炎性反應(yīng)區(qū)域的作用證明α-烯醇化酶也可能參與肝纖維化早期的炎性反應(yīng)。然而隨著疾病進(jìn)展到不可逆的纖維化晚期，很多因素參與到發(fā)病機(jī)制里，肝硬化期細(xì)胞外基質(zhì)比正常肝臟高6倍，因此推測(cè)α-烯醇化酶在肝纖維化早期作為一種促炎因子可起到重要作用，隨著疾病發(fā)展，細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)揮主要作用，α-烯醇化酶的作用會(huì)逐漸減退，同時(shí)導(dǎo)致宿主對(duì)α-烯醇化酶的免疫應(yīng)答減少。

肝纖維化的早發(fā)現(xiàn)、早治療可在一定程度上阻止疾病的發(fā)展，因此診斷早期纖維化的血清標(biāo)志物非常重要，本研究證實(shí)了α-烯醇化酶作為一種潛在的預(yù)測(cè)因子對(duì)肝纖維化的早期診斷價(jià)值，其對(duì)早期干預(yù)治療、防止進(jìn)展到肝硬化期、提高患者的生存率具有一定的應(yīng)用價(jià)值。