木槿ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

任雪羽，王曉紅，肖 芬，周 英

(中南林業(yè)科技大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙 410004)

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性，又稱ISSR(Inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記技術(shù)，是在PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行樣本檢測(cè)的DNA分子標(biāo)記[1]。具有模板需求量少、多態(tài)性豐富、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、信息量大等優(yōu)點(diǎn)[2]，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于植物遺傳多樣性檢測(cè)[3-5]、親緣關(guān)系分析[6-8]、品種鑒定[9-11]及誘變育種材料的鑒定與選擇[12-14]研究中。木槿(HibiscussyriacusL.)為錦葵科木槿屬植物，開花于少花的夏秋季節(jié)，花大色艷，花期長(zhǎng)，是優(yōu)良的園林觀花樹種，兼具藥用與食用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)主要研究集中在木槿繁殖技術(shù)[15-16]、抗性水平[17-18]等方面，對(duì)木槿的分子生物學(xué)研究較為落后。鑒于此，探索適宜木槿各品種的ISSR-PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化，為開展木槿分子水平研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 于湖南省長(zhǎng)沙市中南林業(yè)科技大學(xué)木槿苗圃中，采集紫花單瓣、馬麗娜、白綢、玫瑰紅、中國(guó)薄綢、紫玉、牡丹木槿、木橋、大白花、薰衣草、哈馬博、雅致木槿、薰衣草薄綢、白花重瓣、紫柱、藍(lán)鳥、紅心、千層紅、紅暈、花斑、漢桑、阿娘、茹碧、忠武等24個(gè)木槿品種(編號(hào)分別為CK和1—23)的頂芽向下第2～4片葉片進(jìn)行試驗(yàn)。采摘后放入液氮中備用。

1.1.2 生化試劑 320高效植物基因組提取試劑盒(DP320)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖、Gene Green核酸染料、Taq酶(R001AM)均購(gòu)自Takara寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司2006 年公布的引物序列，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取與檢測(cè) 使用天根320高效植物基因組DNA 提取試劑盒提取葉片DNA[19]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA的完整性，采用BIO-RAD Doc-2000自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.2.2 ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化 以紫花單瓣木槿DNA為模板，以初步篩選的UBC899號(hào)引物，即5′-CATG(GT)2TGGTCATTGTTCCA-3′，作為固定引物，對(duì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增的主要參數(shù)進(jìn)行L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，每個(gè)處理重復(fù)2次。各處理總體積為25 μL，均加入2.5 μL 10×buffer(Mg2+free)，不足用超純水補(bǔ)足。

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系中各因素的配比設(shè)置

在PCR儀(BIO-RAD S1000 Thermal Cycler)上設(shè)置擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min，4 ℃保溫。

根據(jù)正交試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)組合進(jìn)行退火溫度單因素試驗(yàn)。溫度設(shè)置以引物Tm值為基準(zhǔn)上下浮動(dòng)1～2 ℃。設(shè)置了50～60 ℃的退火溫度區(qū)間。

1.2.3 ISSR-PCR產(chǎn)物檢測(cè) 將10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer混勻，加入1.2%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中。電壓110 V，電泳25 min后于自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。對(duì)各組擴(kuò)增條帶打分：條帶表現(xiàn)清晰穩(wěn)定，多態(tài)性高，記16 分；沒有條帶，記1 分。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用EXCEL對(duì)正交試驗(yàn)的分值進(jìn)行直觀分析，求出同一因素同一水平下的均值ki，及同一因素不同水平下平均值的極差R值。用SPSS 22.0進(jìn)行正交試驗(yàn)因素間的方差分析及Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取效果分析

通過凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)提取的木槿DNA質(zhì)量較好，亮度高，主帶清晰，無拖帶(圖1)，符合后續(xù)PCR擴(kuò)增要求。

圖1 部分木槿品種基因組DNA電泳結(jié)果Fig.1 Detection of genomic DNA of some materials by electrophoresis

2.2 ISSR-PCR體系的建立與優(yōu)化

2.2.1 PCR正交試驗(yàn)直觀分析 如圖2所示，在16個(gè)反應(yīng)組合中，第5、6、9、10組沒有擴(kuò)出條帶，其余組合均擴(kuò)增出可見條帶。

極差R值反映不同因素對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響程度。R越大，影響越顯著。由表2可以看出，各因素對(duì)木槿ISSR(25 μL)反應(yīng)體系的影響依次為：Mg2+濃度>Taq酶用量>dNTPs濃度>模板DNA用量>引物濃度。平均值ki則反映了因素在該水平下對(duì)反應(yīng)體系的影響程度。結(jié)合圖2可直觀看出，16個(gè)組合中，第8組擴(kuò)增效果最好，其直觀分析分值最高。為了進(jìn)一步確定木槿PCR體系的最優(yōu)組合，進(jìn)行方差分析。

泳道1—16分別對(duì)應(yīng)表1正交組合編號(hào);M.D2000 Marker

2.2.2 PCR正交試驗(yàn)方差分析 方差分析結(jié)果表明，Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度的P小于0.01(表3)，即Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度對(duì)木槿PCR反應(yīng)體系有極顯著影響。模板DNA用量和引物濃度的P大于0.05，則二者對(duì)PCR體系無顯著影響。同時(shí)，由F值可知，Taq酶用量、Mg2+濃度、dNTPs濃度三因素對(duì)反應(yīng)體系的重要性與直觀分析一致，可對(duì)三因素進(jìn)行多重比較。

表2 不同因素影響下PCR擴(kuò)增結(jié)果直觀分析

表3 不同因素影響下PCR擴(kuò)增結(jié)果方差分析

續(xù)表3 不同因素影響下PCR擴(kuò)增結(jié)果方差分析

注：**代表在0.01水平差異顯著。

Note：** means significant difference at 0.01 level.

Mg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系的影響最大，且隨濃度增加而上升，當(dāng)濃度為2.0 mmol/L時(shí)均值最高(圖3)。同時(shí)從泳道條帶擴(kuò)增有無的情況可直觀看出Mg2+濃度對(duì)于PCR反應(yīng)體系的重要性，以2.0 mmol/L Mg2+為該體系中最佳水平。

Taq酶用量在PCR反應(yīng)體系中的影響水平僅次于Mg2+濃度。Taq酶用量過高或過低均易產(chǎn)生非特異性條帶，致使條帶減弱，清晰度下降[20]。故從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，選擇0.75 U為Taq酶最佳反應(yīng)用量。

dNTPs濃度為0.10 mmol/L時(shí)與其余三水平有極顯著差異，且均值隨dNTPs濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)(圖3)。從電泳結(jié)果來看，泳道2、8、11、13均能擴(kuò)出較為清晰的條帶。故可認(rèn)為，0.10 mmol/L dNTPs為最佳水平。

圖3 不同Mg2+濃度、Taq酶用量、dNTPs濃度下估計(jì)邊際平均值多重比較分析Fig.3 Multiple comparative analysis of estimated marginal mean values at different Mg2+ concentration, Taq enzyme dosage and dNTPs concentration

2.2.3 退火溫度對(duì)木槿ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響 50～60 ℃的退火溫度區(qū)間擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，以泳道G、H兩者最佳，即50.9、50.0 ℃。其中,50.0 ℃下電泳的條帶清晰，亮度高，故選擇50.0 ℃作為最佳退火溫度。

2.3 木槿最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的驗(yàn)證

以紫花單瓣木槿為對(duì)照，對(duì)建立的ISSR-PCR反應(yīng)體系并隨機(jī)引物UBC 822號(hào)進(jìn)行24個(gè)木槿品種擴(kuò)增驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖5所示。擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定，無拖帶，多態(tài)性高。證明所得反應(yīng)體系與反應(yīng)程序?qū)δ鹃染哂羞m宜性與穩(wěn)定性。

A—H泳道退火溫度分別為60.0、59.3、58.1、56.3、54.0、52.3、50.9、50.0 ℃;M.D2000 Marker

圖5 最佳反應(yīng)體系并隨機(jī)引物UBC822號(hào)對(duì)24個(gè)木槿品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Amplification of 24 Hibiscus species by the optimal reaction system with random primer UBC822

3 結(jié)論與討論

目前， ISSR-PCR試驗(yàn)條件常用的優(yōu)化方法有2種，即單因子優(yōu)化法和正交試驗(yàn)優(yōu)化法[20]。單因子優(yōu)化法是對(duì)各影響因素單獨(dú)研究，擁有操作簡(jiǎn)單快捷的優(yōu)點(diǎn)，但工作量大，不能兼顧各影響因素之間的相互作用，故運(yùn)用較少；而正交試驗(yàn)法，在減少試驗(yàn)次數(shù)與工作量的同時(shí)，可均衡分散、綜合各因素對(duì)結(jié)果的影響，是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能夠較快地找到最優(yōu)水平組合[21]。

本試驗(yàn)綜合運(yùn)用了2種試驗(yàn)方法，分析了各因素對(duì)木槿ISSR-PCR體系的影響，最終得出了適宜木槿ISSR-PCR的反應(yīng)體系(25 μL)：10×buffer(Mg2+free)2.5 μL、Taq酶0.75 U、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物濃度0.5 μmol/L。最佳退火溫度為50.0 ℃。