吳倩倩，許 鑫，陳欽璽，闞云超，姚倫廣，王新衛(wèi)，冀 君

(1.南陽師范學(xué)院 南陽市獸醫(yī)生物工程技術(shù)研究中心/河南省伏牛山昆蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 南陽 473061； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病[1]。IB在肉雞臨床上多以呼吸道癥狀和腎腫為特征，會引起高達(dá)30%的死淘率；蛋雛雞感染IB后，除可引起死亡外,還會造成母雞生殖系統(tǒng)的永久不可逆性損傷，表現(xiàn)為輸卵管和卵巢發(fā)育不良或輸卵管、子宮大量積水囊腫，最終造成“假母雞”，出現(xiàn)無產(chǎn)蛋高峰、產(chǎn)蛋數(shù)量及蛋品質(zhì)下降現(xiàn)象。此外，IB還有“腺胃型”、“肌肉損傷型”和其他復(fù)雜的臨床癥狀，除了能夠引起由雞的生產(chǎn)性能下降所導(dǎo)致飼料報(bào)酬降低外，當(dāng)其與大腸桿菌、支原體以及其他病毒性疾病等混合感染時(shí)還會加大臨床觀診難度，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失并威脅養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展[2]。

IBV屬于冠狀病毒科冠狀病毒亞科的Gamma冠狀病毒，病毒基因組為不分節(jié)的單股正鏈RNA，全長約27.6 kb，編碼小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和纖突蛋白(S)等4種主要結(jié)構(gòu)蛋白[3-4]。纖突蛋白(S)與宿主細(xì)胞膜上的病毒受體結(jié)合后被宿主細(xì)胞的蛋白酶裂解為N端的S1蛋白和C端的S2蛋白[5]。其中，S1蛋白與IBV的感染性、致病性及組織嗜性密切相關(guān)，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體、血凝抑制抗體及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答[6-8]，它也是決定IBV血清型特異性抗原決定簇的主要蛋白質(zhì)[9-10]。由于IBV復(fù)制依賴RNA聚合酶，而RNA聚合酶缺乏校正能力[11]，因此，病毒在復(fù)制過程中極易發(fā)生變異或重組。且隨著疫苗的使用，會進(jìn)一步加快IBV的基因變異。由于IBV不同毒株間S1基因變異較大，而S1基因序列會隨著IBV毒株的進(jìn)化發(fā)生差異累積，導(dǎo)致IBV毒株間的交叉保護(hù)程度減弱甚至完全喪失[12-13]。S1基因核苷酸序列的插入、缺失、點(diǎn)突變或重組可直接導(dǎo)致眾多血清型或基因型的出現(xiàn)[14]。因此，基于S1基因的序列差異分析是IBV分子流行病學(xué)調(diào)查內(nèi)容中的重點(diǎn)[15-17]。

本研究于2017年春季和秋季從河南省不同發(fā)病雞場采集的疑似IB發(fā)病蛋雞病料中分離到3株IBV，對其S1基因進(jìn)行克隆、測序和序列分析，以期了解河南省IBV的流行情況，為有效防控IB提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試病料與雞胚來源 供試病料為采集自南陽、信陽和安陽市雞場疑似IBV感染的病死蛋雞的氣管、肺臟和腎臟等；9日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要耗材與試劑 pMD18-T載體、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞、DNA分子質(zhì)量Marker購自大連TaKaRa公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit、TransScript One-Step RT-PCR SuperMix購自北京全式金生物公司；DNA純化、回收試劑盒購自美國OMEGA公司。

1.2 IBV的分離與鑒定

將疑似感染IBV的病死蛋雞的氣管、腎臟等組織浸泡液氮并研磨成細(xì)粉，再加入5倍體積的冷凍PBS緩沖液(含200 U/mL青霉素和200 μg/mL鏈霉素)后混勻，反復(fù)凍融3次，5 000×g離心10 min，收集上清液后通過0.2 μm濾膜進(jìn)行過濾。取0.2 mL濾液接種于9日齡SPF雞胚尿囊腔，于37 ℃孵育48 h后收取雞胚的尿囊液，如此重復(fù)盲傳3代。抽提盲傳3代后的雞胚尿囊液病毒總RNA，采用M基因和3′UTR的檢測引物，進(jìn)行RT-PCR檢測。檢測引物參考尚輝琴等[18]的研究，即用于擴(kuò)增M基因的上游引物序列為5′-CCTAAGAACGGTTGGAAT-3′，下游引物序列為5′-TACTCTCTACACACACAC-3′，擴(kuò)增目的條帶長度為290 bp；用于擴(kuò)增3′UTR保守基因片段的上游引物序列為5′-GGAAGATAGGCATGTAGCTT-3′，下游引物序列為5′-CTAACTCTATACTAGCCTAT-3′，擴(kuò)增目的條帶長度為740 bp。

1.3 IBV分離株S1基因的克隆與測序

根據(jù)GenBank中公布的IBV的基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)S1基因引物(上游引物為5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′，下游引物為5′-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′)。參照TransScript One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒中的說明書，以提取的雞胚尿囊液病毒總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL：總RNA 0.5 μL，R-Mix 10 μL，E-Mix 0.3 μL，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O補(bǔ)加至20 μL。RT-PCR程序：45 ℃ 30 min，95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。電泳后回收RT-PCR產(chǎn)物，將其連接至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中。最后將篩選出的陽性菌液，送至蘇州泓迅生物科技有限公司測序，并對測序鑒定正確的IBV分離株進(jìn)行命名。

1.4 IBV分離株S1基因序列的同源性分析

將獲得的測序鑒定正確的IBV分離株S1基因序列用DNASTAR 7.1軟件包中的“Seqman”進(jìn)行拼接，并以NCBI下載的50株IBV的S1基因序列為參考進(jìn)行同源性比較分析(表1)。使用MEGA 5.05軟件中的“Clustal W”先進(jìn)行多序列比對，再采用Neighbor-Joining方法，對IBV分離株和參考株的S1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，參考LI等[19]研究中對IBVS1基因的分型方法。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，得知核苷核序列和氨基酸序列的同源性。使用SimPlot 3.5.1和RDP 4.36軟件進(jìn)行IBVS1基因遺傳重組分析。

表1 50株IBV參考毒株Tab.1 50 IBV reference strains

續(xù)表1 50株IBV參考毒株Tab.1(Continued) 50 IBV reference strains

注：ND表示沒有記錄。裂解位點(diǎn)分別為HRRRR1：His-Arg-Arg-Arg-Arg；RRFRR2：Arg-Arg-Phe-Arg-Arg；RRSRR3：Arg-Arg-Ser-Arg-Arg；HRRKR4：His-Arg-Arg-Phe-Arg；HRHKR5：His-Arg-His-Lys-Arg；RRLRR6：Arg-Arg-Leu-Arg-Arg；RRSKR7：Arg-Arg-Ser-Phe-Arg；RRHRR8：Arg-Arg-His-Arg-Arg；HRFRR9：His-Arg-Phe-Arg-Arg。

Note：ND means no documentation.Cleavage recognition motifs were HRRRR1:His-Arg-Arg-Arg-Arg;RRFRR2:Arg-Arg-Phe-Arg-Arg;RRSRR3:Arg-Arg-Ser-Arg-Arg;HRRKR4:His-Arg-Arg-Phe-Arg;HRHKR5:His-Arg-His-Lys-Arg;RRLRR6:Arg-Arg-Leu-Arg-Arg;RRSKR7:Arg-Arg-Ser-Phe-Arg;RRHRR8:Arg-Arg-His-Arg-Arg;HRFRR9:His-Arg-Phe-Arg-Arg.

2 結(jié)果與分析

2.1 IBV病毒的分離與鑒定

如圖1所示，以雞胚尿囊液中提取的病毒總RNA作為模板，利用M基因和3′UTR的檢測引物通過RT-PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，分別擴(kuò)增出290 bp與740 bp的條帶，與預(yù)期目的條帶大小一致，表明疑似感染IBV的病死雞確實(shí)有IBV感染。

M：DL2000 DNA Marker；1、2：M和3′UTR基因的RT-PCR產(chǎn)物；3、4：陰性對照

2.2 IBV分離株S1基因的克隆與測序

如圖2所示，以雞胚尿囊液中提取的病毒總RNA作為模板，對IBV分離株的S1基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期目的條帶大小一致，約為1 700 bp。測序結(jié)果正確的3個(gè)IBV分離株分別被命名為CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018，其S1基因全長均為1 617 nt，編碼539 aa。

M:DL2000 DNA Marker；1:S1基因的RT-PCR產(chǎn)物；2:陰性對照

2.3 IBV分離株S1基因的遺傳進(jìn)化、同源性和裂解位點(diǎn)分析

如圖3所示，根據(jù)IBVS1基因繪制的遺傳進(jìn)化樹顯示，3個(gè)IBV分離毒株與所有參考毒株主要分成CHⅠ(QX)、4/91(CHⅡ)、CHⅢ、CHⅣ、CHⅤ、CHⅥ、Mass等7個(gè)不同的進(jìn)化分支(基因型)，IBV分離株CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018均屬于4/91(CHⅡ)基因型。如圖4和圖5所示，核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析表明，3個(gè)IBV分離毒株間的核苷酸和氨基酸的同源性較高，核苷酸和氨基酸同源性分別為94.4%～98.7%和93.5%～97.8%；CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/XY911/2017核苷酸和氨基酸同源性高達(dá)98.7%和97.8%；CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/AY119/2018核苷酸和氨基酸同源性分別為94.9%和94.2%；CK/CH/HN/XY911/2017與CK/CH/HN/AY119/2018核苷酸和氨基酸同源性分別為94.4%和93.5%。3個(gè)分離株的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，與位于同一基因型的參考毒株間同源性較高，與我國使用的Mass型常規(guī)疫苗H120和H52毒株的核苷酸和氨基酸同源性最低，分別僅為78.3%～78.4%和74.8%～75.4%，與4/91(CHⅡ)型疫苗4/91毒株的核苷酸和氨基酸同源性較高，分別達(dá)到94.7%～99.3%和93.9%～98.1%。推導(dǎo)的氨基酸序列顯示，CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/XY911/2017基因裂解位點(diǎn)為RRSRR，CK/CH/HN/AY119/2018為RRFRR，與基因型4/91(CHⅡ)分支中參考毒株裂解位點(diǎn)一致。

圖3 IBV分離株與參考毒株S1基因進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic trees constructed based on S1 gene from IBV isolates and reference strains

圖4 IBV分離株與參考毒株核苷酸序列同源性

圖5 IBV分離株與參考毒株氨基酸序列同源性

2.4 IBV分離株S1基因的遺傳重組分析

如圖6所示，利用SimPlot 3.5.1和RDP 4.36對IBV分離株的S1基因進(jìn)行遺傳重組分析發(fā)現(xiàn)，毒株CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/XY911/2017均存在序列交叉，提示可能有重組事件發(fā)生。由表2可知，CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/XY911/2017均是由基因型為4/91(CHⅡ)的IBV毒株JP/Saitama/2006和LZ07在S1基因處發(fā)生重組而產(chǎn)生的新毒株。CK/CH/HN/XY911/2017核苷酸序列796—1 340 nt與推測的親本毒株LZ07高度同源，相似性達(dá)98.9%，其他S1基因核苷酸序列與推測的親本毒株JP/Saitama/2006相似性達(dá)91.8%，RDP 4.36軟件分析計(jì)算的P值為8.534×10-14。CK/CH/HN/NY1206/2017核苷酸序列797—1 339 nt與推測的親本毒株LZ07高度同源，相似性達(dá)98.9%，其他S1基因核苷酸序列與推測的親本毒株JP/Saitama/2006相似性達(dá)92.4%，RDP 4.36軟件分析計(jì)算的P值為1.312×10-14。

圖6 SimPlot 3.5.1軟件檢測IBV分離株的S1基因遺傳重組結(jié)果Fig.6 Results of detecting recombinant S1 gene of IBV isolates by SimPlot 3.5.1 software

StrainGenotype/nt Break pointsBeginEndMajor parentStrainGenotype/%SimilarityMinor parentStrainGenotype/%SimilarityPP valueCK/CH/HN/XY911/20174/91(CHⅡ)7961 340JP/Saitama/20064/91(CHⅡ)91.8LZ074/91(CHⅡ)98.98.534×10-14CK/CH/HN/NY1206/20174/91(CHⅡ)7971 339JP/Saitama/20064/91(CHⅡ)92.4LZ074/91(CHⅡ)98.91.312×10-14

3 結(jié)論與討論

IB是一種對家禽養(yǎng)殖業(yè)具有重要影響且全球分布的傳染性疾病。苗立中[20]對山東地區(qū)分離的48株IBV進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，有46株屬于CHⅠ(QX)基因型，2株屬于Mass基因型，表明CHⅠ(QX)基因型已成為山東地區(qū)IBV流行的優(yōu)勢基因型。XU等[4]研究發(fā)現(xiàn)，近年來，TW Ⅰ型病毒在中國的流行呈上升趨勢，除此之外，GI-19型和常用的4/91(CHⅡ)型疫苗之間發(fā)生了重組事件，從而產(chǎn)生了不同的IBV分離株。

本研究參照LI等[19]建立的分型方法，基于S1基因的遺傳進(jìn)化樹進(jìn)行分型，得到3株IBV分離株CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/AY119/2018，它們均屬于4/91(CHⅡ)基因型。其中IBV分離株CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/XY911/2017核苷酸及推導(dǎo)出的氨基酸同源性較高，可能與地理位置距離較近有關(guān)。有研究表明，4/91(CHⅡ)基因型毒株主要具有4個(gè)裂解位點(diǎn)(RRFRR、RRSRR、RRLRR、HRFRR)[19]，本研究中IBV分離株CK/CH/HN/NY1206/2017與CK/CH/HN/XY911/2017基因裂解位點(diǎn)為RRSRR，CK/CH/HN/AY119/2018為RRFRR，裂解位點(diǎn)并未產(chǎn)生新的突變。

推測本研究中IBV分離株CK/CH/HN/NY1206/2017、CK/CH/HN/XY911/2017為發(fā)生S1基因遺傳重組的毒株，通過SimPlot 3.5.1和RDP 4.36軟件對分離株進(jìn)行基因遺傳重組分析，發(fā)現(xiàn)上述2株分離毒株均是由4/91(CHⅡ)基因型毒株LZ07和JP/Saitama/2006重組產(chǎn)生的新毒株。目前，我國雞場使用的IBV免疫疫苗主要有Mass型(H120、H52、W93和Ma5)和LDT3型[13]。本研究中，IBV毒株CK/CH/HN/XY911/2017和CK/CH/HN/NY1206/2017與使用的Mass型常規(guī)疫苗H120和H52株的核苷酸和氨基酸同源性最低，僅為78.3%～78.4%和74.8%～75.4%，與4/91(CHⅡ)型疫苗4/91株的核苷酸和氨基酸同源性較高，達(dá)到94.7%～99.3%和93.9%～98.1%。本研究表明，河南省致蛋雞產(chǎn)蛋下降的IBV流行基因型相對統(tǒng)一，使用4/91(CHⅡ)型疫苗應(yīng)可提高蛋雞抗IBV的保護(hù)率。但是由于IBV極易發(fā)生基因變異和重組，因此，持續(xù)性分子流行病學(xué)監(jiān)控對防控IB具有重要的意義。