劉昊,楊雨晴,邵一飛,高偉,陳永臣,姚宇峰

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番茄種子消毒方法探究

劉昊1,楊雨晴1,邵一飛1,高偉2*,陳永臣1,姚宇峰2*

1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100083 2. 北京林業(yè)大學(xué)理學(xué)院, 北京 100083

番茄種子表面常常帶有病原微生物，故在培養(yǎng)番茄無菌苗時(shí)，需要進(jìn)行消毒。傳統(tǒng)番茄種子的消毒劑是氯化汞，而其較大的毒性和消毒原理限制其在實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際生產(chǎn)上的應(yīng)用。因此，本研究開發(fā)出一套新的采用無毒或低毒試劑的消毒方法來制備番茄無菌苗，從而消除重金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用，并排除雜菌污染，進(jìn)而為探究蛋白類物質(zhì)對(duì)番茄的促生作用做前期實(shí)驗(yàn)方法的研究鋪墊。對(duì)氯化汞、次氯酸鈉和過氧化氫三種消毒劑采用正交實(shí)驗(yàn)，選取各自合適的濃度和時(shí)間梯度聯(lián)合洗衣粉和75%乙醇消毒效果進(jìn)行最佳消毒條件的摸索。結(jié)果表明，20%次氯酸鈉消毒5 min以及8%次氯酸鈉消毒+1%吐溫20消毒1 min的消毒效果較好，但吐溫20對(duì)幼苗的苗重有一定的抑制作用。運(yùn)用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和進(jìn)一步摸索消毒條件，結(jié)果表明，次氯酸鈉消毒對(duì)種子萌發(fā)率影響不大，次氯酸鈉濃度在10%~40%的差異不顯著，故最佳的消毒方式為10%次氯酸鈉消毒5 min。通過蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行消毒條件的驗(yàn)證，最終表明，建立的番茄種子消毒方法可以用于研究活性物質(zhì)對(duì)番茄的生理作用，且消毒效果較好。

種子消毒; 番茄

番茄（）作為一種模式植物，被用于研究植物生理、發(fā)育、遺傳等多項(xiàng)領(lǐng)域。番茄種子表面常常帶有病原微生物，被認(rèn)為是許多作物病害發(fā)生的初侵染源[1,2]，所以在培養(yǎng)番茄無菌苗時(shí)，需要先進(jìn)行消毒。在傳統(tǒng)番茄種子消毒的方法中，常使用氯化汞。然而氯化汞處理后種子萌發(fā)時(shí)間晚，且硝酸銀和氯化汞處理會(huì)導(dǎo)致番茄苗的向地性消失[3]。氯化汞較大的毒性和其消毒原理限制了其在實(shí)驗(yàn)室及實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。從文獻(xiàn)角度來看，次氯酸鈉、過氧化氫和乙醇等是常用的消毒劑。然而次氯酸鈉滅菌時(shí)間長(zhǎng)，效果不夠理想，但是從萌發(fā)率和污染率綜合考慮認(rèn)為3～4%次氯酸鈉的效果較好[4,5,6]。由于番茄種子表面有微絨毛，不易消毒徹底。可以采用加入吐溫20的方法提高效果，此外，在培養(yǎng)過程中，還可以采用添加蔗糖、無機(jī)鹽等方法促進(jìn)壯苗的形成[7]。

本研究采用三因子三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，減小工作量，增大探索范圍，對(duì)氯化汞、次氯酸鈉和過氧化氫三種消毒劑進(jìn)行條件摸索。采納文獻(xiàn)報(bào)道的最佳條件作為中間水平，氯化汞處理作為陽性對(duì)照，滅菌水處理作為陰性對(duì)照；且一并探索最佳的氯化汞處理?xiàng)l件。

本研究旨在探索一套采用無毒或低毒試劑的化學(xué)消毒方法并適用于番茄種子消毒的實(shí)驗(yàn)方法，既消除重金屬離子對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用，也可排除雜菌對(duì)番茄的作用，并為探究蛋白類物質(zhì)對(duì)番茄的促生作用做前期實(shí)驗(yàn)方法的研究鋪墊[2]。

1 材料與方法

1.1 材料

市面購(gòu)買的佳紅5號(hào)番茄種子；挑選無霉變的種子，并隨機(jī)分組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1.1 番茄種子培養(yǎng)方法培養(yǎng)介質(zhì)選用濾紙或1.3%的瓊脂溶液；在自然濕度下，28 ℃全光照培養(yǎng)。通過照度計(jì)（型號(hào)TA8131，產(chǎn)自中國(guó)蘇州特安斯電子有限公司）測(cè)量光照情況，光強(qiáng)范圍為365~665 Lux，接受光照距離251 mm~324 mm。

1.2.1.2 番茄種子消毒方法稱取0.7~0.8 g番茄種子（通常0.7~0.8 g質(zhì)量的佳紅5號(hào)番茄種子約為25粒），置于2 mL離心管中，加入1 mL洗衣粉溶液，震蕩約10次，用移液器吸出液體，更換槍頭注入1 mL滅菌蒸餾水，震蕩充分，用移液器吸出液體，重復(fù)4~5次；再加入1 mL 75%乙醇，消毒30 s，用移液器吸出液體，更換槍頭，加入1 mL滅菌蒸餾水，如上述沖洗4~5次；加入消毒劑處理，如需加入吐溫20，則優(yōu)先加入吐溫20溶液；再用滅菌水沖洗4~5次；最后統(tǒng)一加入1 mL滅菌水，離心管置于50 ℃水浴鍋浸種15 min。流程見圖1。

圖1 種子消毒流程圖

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)每日監(jiān)測(cè)污染率、萌發(fā)率兩項(xiàng)指標(biāo)，并在萌發(fā)率穩(wěn)定三天后測(cè)定苗總重，其中污染的種子可能萌發(fā)也可能未萌發(fā)。各指標(biāo)計(jì)算方法如下：污染率（%）=污染數(shù)（個(gè)）/接種數(shù)（個(gè)）*100%；萌發(fā)率（%）=萌發(fā)數(shù)（個(gè)）/接種數(shù)（個(gè)）*100%。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 不同介質(zhì)對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響將0.6~0.7 g種子（約25~30粒）接種于濾紙或1.3%瓊脂培養(yǎng)基上，每種處理進(jìn)行兩組重復(fù)，每天記錄萌發(fā)率及污染率，萌發(fā)率穩(wěn)定3 d后對(duì)莖長(zhǎng)和根長(zhǎng)做測(cè)量并記錄，并實(shí)時(shí)記錄培養(yǎng)過程中的定性情況。用滅菌水浸種作為對(duì)照，水面稍沒過種子即可。

1.2.3.2 不同消毒劑、消毒劑濃度、消毒時(shí)間及吐溫20含量對(duì)番茄種子消毒效果的影響采用三因子三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各組水平依消毒劑種類不同而定。每種處理接種約10粒，重復(fù)3次。每天統(tǒng)計(jì)各組萌發(fā)率，3 d后，對(duì)總萌發(fā)質(zhì)量做測(cè)量并記錄。對(duì)照1為用滅菌水代替消毒劑，其余處理同其他實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照2為所有處理均改用滅菌水。三種消毒劑的正交實(shí)驗(yàn)因子水平表如表1。

1.2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)所得的最優(yōu)消毒組合進(jìn)行實(shí)施，并對(duì)其中一個(gè)因素進(jìn)行三水平梯度單因素實(shí)驗(yàn)，并與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，檢驗(yàn)該最佳配比的可靠性。

1.2.3.4 番茄種子表面觀察利用體視顯微鏡觀察并拍照干燥的蒸餾水和吐溫20溶液震蕩前與蒸餾水和吐溫20溶液震蕩后的對(duì)比狀態(tài)下番茄種子的表面情況。以解釋吐溫20溶液對(duì)消毒過程的影響。

1.2.3.5 實(shí)例驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)將本實(shí)驗(yàn)室分離純化得到的一種能夠促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)處理最佳方法消毒的番茄種子，觀察其消毒效果及消毒是否對(duì)蛋白質(zhì)的功能有所影響。

表 1 三種消毒劑的正交實(shí)驗(yàn)因子水平表L9(34)

備注：陰性對(duì)照1：采用滅菌水代替消毒劑，其余與實(shí)驗(yàn)組處理一致；陰性對(duì)照2：完全滅菌水處理。

Note: Negative control 1: using sterile water instead of disinfectants and the rest is the same as experimental group; Negative control 2: completely sterile water treatment

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

應(yīng)用DPS v7.05版數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理。多重比較方法均采用LSD法，種子萌發(fā)率、污染率均采用反正弦平方根數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換處理。應(yīng)用matlab 7.1進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)效果的影響

從圖2和圖3可以看出，培養(yǎng)介質(zhì)有利于番茄種子的萌發(fā)和污染率的降低。從表2來看，濾紙和瓊脂兩介質(zhì)的不同對(duì)番茄種子萌發(fā)的影響不顯著；同時(shí)對(duì)番茄種子萌發(fā)后的莖長(zhǎng)影響不顯著而對(duì)根長(zhǎng)影響顯著，瓊脂更利于幼苗的根發(fā)育。此外，瓊脂作為介質(zhì)有透明性好，柔軟易于根測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)。因此，使用瓊脂作為介質(zhì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)更為恰當(dāng)。

圖2 培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)種子萌發(fā)率的影響

圖3 培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)種子污染率的影響

表2 培養(yǎng)介質(zhì)對(duì)種子的影響情況

備注：大寫字母表示1%極顯著水平，小寫字母表示5%顯著水平。

Note:The capital letter indicates the 1% extreme level, the small letter indicates the 5% significant level.

2.2 不同消毒劑、消毒劑濃度、消毒時(shí)間及吐溫20含量對(duì)番茄種子消毒效果的影響

從兩個(gè)對(duì)照組來看，采用洗衣粉和酒精處理對(duì)番茄種子的消毒效果有極顯著的提高。對(duì)照組1和對(duì)照組2的萌發(fā)率分別為77%和73%，污染率為37%和63%。且污染導(dǎo)致幼苗整體生長(zhǎng)不佳。從表3幼苗質(zhì)量的方差分析來看，洗衣粉和酒精處理能夠極顯著地提高番茄種子萌發(fā)后的幼苗質(zhì)量。

從表4表5表6可見，氯化汞組的最佳組合為0.05%氯化汞+1%吐溫20消毒2 min；次氯酸鈉組的最佳組合為20%次氯酸鈉消毒5 min以及8%次氯酸鈉消毒+1%吐溫20消毒1 min；過氧化氫組的最佳組合為2%或者10%過氧化氫+1%吐溫20消毒10 min。從污染率而言，次氯酸鈉組和氯化汞組均無污染現(xiàn)象，從幼苗質(zhì)量而言，次氯酸鈉組的整體效果優(yōu)于氯化汞組和過氧化氫組，故采用次氯酸鈉組的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。此外，吐溫20對(duì)三種消毒劑的消毒效果均有促進(jìn)作用，但與次氯酸鈉聯(lián)合使用時(shí)，會(huì)降低幼苗的質(zhì)量，故在驗(yàn)證時(shí)，采用20%次氯酸鈉消毒5 min。

表 3 對(duì)照組方差分析與字母表示法

表4 氯化汞組正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 次氯酸鈉組正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

從表7可見，用次氯酸鈉消毒和用滅菌水消毒對(duì)消毒結(jié)果的影響極顯著。次氯酸鈉消毒劑濃度對(duì)番茄種子的消毒效果影響不顯著。這與正交結(jié)果略有差異，但由于差異并不顯著，采用10%~40%次氯酸鈉均可。

表6 過氧化氫組正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)多重比較

2.4 番茄種子表面觀察

A為干燥條件下的番茄表面：可以看見番茄種子的表面遍布絨毛，這些絨毛會(huì)成為附著細(xì)菌和真菌的地點(diǎn)，且容易在液體消毒的過程中產(chǎn)生大量氣泡，阻礙了消毒劑與表面接觸，從而阻礙消毒劑作用于番茄表面。

B和C為滴加吐溫20與蒸餾水后的番茄表面情況：可以看見加入吐溫20的情況和加入蒸餾水的情況并無太大差異，顯微鏡下吐溫20的番茄表面氣泡略少于蒸餾水。

D和E為模擬消毒過程（離心管震蕩20 s）后的番茄表面情況：與滴加時(shí)的情況相近。

圖 4 種子消毒過程的觀察

2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)表8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知該蛋白對(duì)番茄的根長(zhǎng)的作用呈低促高抑，方差分析表明抑制、促進(jìn)作用差異極顯著。說明該方法對(duì)蛋白質(zhì)促進(jìn)番茄種子根長(zhǎng)的作用不會(huì)有影響，可以用于研究蛋白質(zhì)對(duì)番茄種子的作用。

表8 蛋白質(zhì)功能實(shí)驗(yàn)的多重比較

3 討 論

三種消毒劑在消毒過程中表現(xiàn)不同，但各有優(yōu)劣。氯化汞的優(yōu)點(diǎn)為消毒快、徹底、作用廣泛，用量少，物質(zhì)穩(wěn)定，保質(zhì)期長(zhǎng)；缺點(diǎn)是毒性大，對(duì)種子損傷大，不易處理，有劇毒，管制。次氯酸鈉的優(yōu)點(diǎn)是消毒快、徹底、作用廣泛，毒性低；缺點(diǎn)是物質(zhì)不穩(wěn)定，有效物質(zhì)濃度會(huì)降低、有機(jī)物會(huì)降低消毒效果、有一定的腐蝕性。過氧化氫的優(yōu)點(diǎn)是無污染；缺點(diǎn)是消毒需要濃度高、有腐蝕性[5-9]。

由于氯化汞的消毒機(jī)理,故在研究外源性物質(zhì)對(duì)幼苗的作用時(shí),不能采用氯化汞做消毒劑。Mickai等首次報(bào)道分別采用0.05%氯化汞、5%或1%硫酸、0.5%磺胺乙汞三種消毒劑消毒番茄對(duì)幼苗無傷害作用，但本文中的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象否定了該結(jié)論，并與魏麗麗等的氯化汞消毒后會(huì)使幼苗喪失向地性的結(jié)果一致。在實(shí)驗(yàn)過程中，次氯酸鈉和過氧化氫均對(duì)種皮有褪色作用[3,10]，這與吳華等的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象一致[11]。種皮在褪色透明后，清晰可見番茄種皮內(nèi)部的子葉與胚的形態(tài)，但并不影響其萌發(fā)率。過氧化氫的氧化性能夠促使種皮腐蝕，使胚根容易伸出，在本研究中，過氧化氫組的萌發(fā)速度在各消毒劑組中是最快的，側(cè)面印證胡重怡等的實(shí)驗(yàn)結(jié)論[12]。也說明過氧化氫作為消毒劑具有良好的開發(fā)潛力，有待進(jìn)一步探索其條件。近年國(guó)外并無對(duì)番茄種子消毒的研究，但國(guó)外對(duì)種子的消毒更多采用次氯酸鹽，表明實(shí)驗(yàn)室中采用次氯酸鹽消毒效果較好，可能是一種趨勢(shì)。結(jié)果也與之相符[13-15]。

吐溫20是一種非離子型表面活性劑，它使消毒劑與材料能夠充分接觸。番茄種子表面有大量的絨毛，在加入表面活性劑之后能夠加強(qiáng)消毒效果[7,16]。董飛等在研究大蔥無菌苗的培養(yǎng)消毒條件時(shí)，加入了吐溫20能夠明顯提高大蔥種子的萌發(fā)勢(shì)、萌發(fā)率，降低其污染率[16]；這與本文的探究結(jié)果相一致，但本研究中還發(fā)現(xiàn)加入吐溫20會(huì)降低番茄幼苗的苗重。

利用無菌苗進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，可以避免微生物的影響：在研究一些物質(zhì)對(duì)植物的作用或植物對(duì)某物質(zhì)的吸收時(shí)，需要避免微生物對(duì)該物質(zhì)的分解或避免微生物的代謝物質(zhì)對(duì)植物的作用?；蛘咴谘芯课⑸锱c植物的相互作用時(shí)，需要避免其他微生物對(duì)該體系的影響，故需要無菌苗的制備[2]。

4 結(jié) 論

在本研究的探索范圍內(nèi)，最佳的消毒方式為20%次氯酸鈉消毒5 min不加吐溫20。整體的消毒步驟為：洗衣粉清洗→滅菌水沖洗4~5次→75%乙醇消毒30 s→滅菌水沖洗4~5次→8%次氯酸鈉+5 min→滅菌水沖洗4~5次→50 ℃滅菌水浸種15 min。吐溫20對(duì)消毒劑的消毒效果有增強(qiáng)作用。

通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，次氯酸鈉的濃度對(duì)消毒效果沒有顯著性影響，但使用次氯酸鈉消毒和不使用差異極顯著。同時(shí)，本研究中發(fā)現(xiàn)，吐溫20有一定的增加消毒劑消毒效果的功效，但對(duì)番茄幼苗的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而對(duì)萌發(fā)率沒有抑制作用。

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Exploration for the Disinfectant Method of Tomato Seed

LIU Hao1, YANG Yu-qing1, SHAO Yi-fei1, GAO Wei2*, CHEN Yong-chen1, YAO Yu-feng2*

1.100083,2.100083,

There are pathogenic microorganisms on the surface of tomato seeds, so it is necessary to sterilize for cultivating the aseptic seedlings of tomato. The traditional disinfectant for tomato seed is mercuric chloride, but its toxicity and sterilization principle limit the application in the laboratory and practical production. Therefore, this study developed a set of new sterilization method by using non-toxic or low-toxic disinfectants in order to eliminate the denaturation effect of heavy metal ions on proteins and exclude the microbial contamination, thus preparing for the exploration of growth-promoting effect of protein on tomato. We used the orthogonal experiment, selected the suitable concentration and time gradient of three kinds of disinfectants, mercuric chloride, sodium hypochlorite and hydrogen peroxide and explored the best sterilization conditions with the combination of washing powder and 75% alcohol. Results show that 20% sodium hypochlorite sterilization 5 minutes or 8% sodium hypochlorite and 1% Tween20 sterilization 1 minutes is better, but Tween20 has certain inhibition to the weight of seedlings. Using the single factor experimental design to verify the results of orthogonal experiment and further explore the sterilization conditions, the results show that the sodium hypochlorite sterilization has little effects on seed germination rate and the concentration of sodium hypochlorite in 10% ~ 40% has no significant difference. So the best way of sterilization is 10% sodium hypochlorite sterilization 5 minutes. The verification of sterilization conditions by using protein solution finally indicates that this established tomato seed sterilization method can be used to study the physiological function of active substances to tomato and the sterilization effect is better.

Seed sterilization; tomato

S641.2

A

1000-2324(2019)03-0393-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.03.008

2018-01-08

2018-03-07

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2018ZY18);北京林業(yè)大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(X201710022144)

劉昊(1996-),男,本科生,專業(yè)方向:微生物與植物相互關(guān)系. E-mail:liuhao1996@bjfu.edu.cn

Author for correspondence.E-mail: w_gao@bjfu.edu.cn;yaoyufeng@126.com