張文韜 章有知

摘要：以黃豆[Giycine max （Linn.） Merrill]幼苗的第一真葉和第二真葉為研究對(duì)象，測(cè)定了第一真葉和第二真葉的可溶性蛋白質(zhì)、光合色素、丙二醛和抗壞血酸含量以及過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶活性。結(jié)果表明，第一真葉與第二真葉中的可溶性蛋白質(zhì)含量沒(méi)有顯著性差異;第二真葉中的葉綠素a和類胡蘿卜素含量高于第一真葉，分別高23.4%和89.9%，第一真葉中的葉綠素b含量高于第二真葉，高76.9%，總光合色素含量在第一真葉與第二真葉中較為接近，第二真葉中葉綠素a/b的值是第一真葉中的2.18倍;第一真葉的丙二醛含量高于第二真葉，前者是后者的3.04倍;第二真葉的抗壞血酸含量高于第一真葉，是后者的1.52倍;兩真葉中未測(cè)到過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性?？箟难岷颗c可溶性蛋白質(zhì)含量、丙二醛含量和葉綠素b含量為負(fù)相關(guān)，與葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量為正相關(guān)。

關(guān)鍵詞：黃豆[Giycine max （Linn.） Merrill];幼苗;第一真葉;第二真葉;生理指標(biāo)

中圖分類號(hào)：S529? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）05-0021-04

Abstract： Soluble protein content， photosynthetic pigment content， MDA content， ascorbic acid content， enzyme activity and peroxidase activity of hydrogen peroxide in the first leaf and the second leaf of soybean [Giycine max （Linn.） Merrill] seedlings were determined. The results showed that there was no significant difference in soluble protein content between the first and second true leaf. The content of chlorophyll a and carotenoid in the second leaf was 23.4% and 89.9% higher than those in the first leaf， respectively. The content of chlorophyll b in the first leaf was 76.9% higher than that in the second leaf. The total photosynthetic pigment content in first leaf and second leaf were close to each other. The value of chlorophyll a/b in the second leaf was about 2.18 times higher than that in the first true leaf. The MDA content in the first true leaf was 3.04 times higher than that in the second true leaf. The content of ascorbic acid in the second leaf was 1.52 times higher than that in the first true leaf. The peroxidase activity and catalase activity could not been determined in these two leaves. Besides that， ascorbic acid content was negatively correlated with the content soluble protein， MDA and chlorophyll b， and was positively correlated with the content of chlorophyll a and carotenoid.

Key words： soybean[Giycine max （Linn.） Merrill]; seedling; the first leaf; the second leaf; physiological index

真葉是維管植物最為重要的器官之一。真葉葉片作為植物主要的光合器官，是植物生長(zhǎng)過(guò)程中能量和物質(zhì)的最主要來(lái)源，其生理狀態(tài)和形態(tài)對(duì)植物的光合作用、蒸騰作用與抗逆性等生理功能以及植物的生長(zhǎng)發(fā)育都有很大的影響。如小麥的旗葉和水稻的劍葉都對(duì)其本身的產(chǎn)量有較大影響。因此研究黃豆[Giycine max （Linn.） Merrill]幼苗真葉葉片的指標(biāo)，判斷其生理學(xué)功能和生理狀態(tài)對(duì)黃豆也具有重要的生產(chǎn)和實(shí)踐意義。本試驗(yàn)選擇黃豆幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中的第一真葉和第二真葉為研究對(duì)象，測(cè)定了第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）、可溶性蛋白質(zhì)、光合色素、丙二醛含量以及過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性等生理指標(biāo)。

擬南芥AsA突變體植株中，AsA含量的降低導(dǎo)致擬南芥細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)受到了抑制，從而使得擬南芥嫩枝生長(zhǎng)速率降低[1]。還有研究發(fā)現(xiàn)，紫黃質(zhì)脫環(huán)氧酶和一些次生代謝物所需的代謝酶類都需要AsA作為輔因子[2]，參與細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。此外，AsA在植物中具有清除自由基和抗氧化的生理功能，在植物的光保護(hù)和光合作用、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂等諸多生理過(guò)程中也有著非常重要的生理調(diào)節(jié)功能[3-5]。此外，在清除植物體內(nèi)因環(huán)境脅迫、光合作用和氧代謝等產(chǎn)生的活性氧的過(guò)程中，AsA可以起到直接的降低作用[6]。植物PS Ⅰ中氧的光還原過(guò)程會(huì)產(chǎn)生H2O2，其必須通過(guò)AsA過(guò)氧化酶清除。AsA同樣也是PS Ⅱ的電子供體[6，7]。因此，植物細(xì)胞內(nèi)AsA含量的增加往往能增強(qiáng)植物抵抗逆境的能力而延緩衰老。鑒于以上原因，在測(cè)定抗壞血酸、可溶性蛋白質(zhì)、光合色素、丙二醛及過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性后，對(duì)抗壞血酸含量與其他生理指標(biāo)的相關(guān)性也初步進(jìn)行了分析。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 試驗(yàn)材料? 選擇大小均一的黃豆種子在裝有河沙的種植盆（長(zhǎng)30 cm，寬30 cm，深10 cm;其中河沙深度8 cm，河沙經(jīng)去離子水清洗）中，6行6列（30顆/盆），塑料薄膜覆蓋，種植盆置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，條件為白天28 ℃/12 h，夜間20 ℃/12 h，光照度為800 μmol/（m2·s），相對(duì)濕度75%，出苗后開(kāi)始每隔1 d向種植盆內(nèi)均勻噴灑Hoagland營(yíng)養(yǎng)液200 mL。待幼苗長(zhǎng)至第三真葉時(shí)，選擇長(zhǎng)勢(shì)整齊植株的第一真葉和第二真葉進(jìn)行測(cè)定。第一真葉和第二真葉樣本數(shù)不少于30。

1.1.2? 試驗(yàn)試劑? 牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白、考馬斯亮藍(lán)G250、85%偏磷酸、濃鹽酸、2，6-二氯酚靛酚、抗壞血酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氫氧化鈉、石英砂、碳酸鈣、愈創(chuàng)木酚、Na2HPO4、KH2PO4、H2O2、96%乙醇，均為分析純，試驗(yàn)用水為去離子水。

1.1.3? 試驗(yàn)儀器? T6新悅分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;HZT-B3000電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;臺(tái)式高速離心機(jī)（Sigma）;pH試紙;UVmini1240紫外分光光度計(jì)（島津）;水浴鍋;電爐（天津泰斯特儀器有限公司）;藥品低溫冰箱（海爾）等。

1.2? 方法

1.2.1? 黃豆葉片的預(yù)處理? 選取黃豆幼苗第一真葉和第二真葉，用去離子水清洗新鮮葉片表面后，用吸水紙吸干表面水分，在電子天平上進(jìn)行稱量，并記錄質(zhì)量。

1.2.2? 生理指標(biāo)含量的測(cè)定? 葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量、光合色素含量、丙二醛含量和過(guò)氧化氫酶活性的測(cè)定和計(jì)算參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行;過(guò)氧化物酶活性的測(cè)定和計(jì)算參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行;抗壞血酸含量的測(cè)定和計(jì)算參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.3? 數(shù)據(jù)分析? 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行，顯著性檢驗(yàn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用兩因素相關(guān)分析中的Spearman相關(guān)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 各生理生化指標(biāo)表現(xiàn)

2.1.1? 光合色素含量? 將試驗(yàn)中測(cè)定的665、649、470 nm處的吸光度按公式進(jìn)行計(jì)算，得出第一真葉和第二真葉中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量，并計(jì)算總光合色素含量和葉綠素a/b，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，第二真葉中的葉綠素a和類胡蘿卜素含量高于第一真葉，分別高23.4%和89.9%;第一真葉中的葉綠素b含量高于第二真葉，高76.9%;總光合色素含量在第一真葉和第二真葉中較為接近。第二真葉中葉綠素a/b是第一真葉中的2.18倍。

對(duì)第一真葉和第二真葉中的光合色素含量值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，葉綠素a的雙尾顯著性檢驗(yàn)P為0.002，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉和第二真葉中葉綠素a含量有極顯著性差異;葉綠素b和類胡蘿卜素的雙尾顯著性檢驗(yàn)P均為0.000，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉和第二真葉中葉綠素b含量和類胡蘿卜素含量均有極顯著性差異;對(duì)葉綠素a/b進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙尾顯著性檢驗(yàn)P均為0.000，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，葉綠素a/b有極顯著性差異。

2.1.2? 可溶性蛋白質(zhì)含量? 由表1可知，黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉的可溶性蛋白質(zhì)含量略高于第二真葉。對(duì)第一真葉和第二真葉中的可溶性蛋白質(zhì)含量值進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙尾顯著性檢驗(yàn)P為0.478，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉和第二真葉中可溶性蛋白質(zhì)含量沒(méi)有顯著性差異。

2.1.3? 丙二醛含量? 由表1可知，黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉的丙二醛含量高于第二真葉，前者是后者的3.04倍。對(duì)第一真葉和第二真葉中的丙二醛含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙尾顯著性檢驗(yàn)P為0.000，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉和第二真葉中丙二醛含量有極顯著性差異。

2.1.4? 抗壞血酸含量? 由表1可知，黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第二真葉的抗壞血酸含量高于第一真葉，是后者的1.52倍。對(duì)第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸含量進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，雙尾顯著性檢驗(yàn)P為0.002，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，第一真葉與第二真葉中抗壞血酸含量有極顯著性差異。

2.1.5? 過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性? 利用分光光度法分別測(cè)定了第一真葉和第二真葉的過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性，但測(cè)定結(jié)果顯示，過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶基本無(wú)活性。

2.2? 抗壞血酸含量與其他各指標(biāo)間的相關(guān)性分析

2.2.1? 抗壞血酸含量與可溶性蛋白質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系? 對(duì)測(cè)定的第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸含量與可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為-0.177，表明抗壞血酸含量與可溶性蛋白質(zhì)含量為負(fù)相關(guān);P為0.738，相關(guān)不顯著（表2）。

2.2.2? 抗壞血酸含量與光合色素含量的相關(guān)關(guān)系? 由表2可知，在黃豆幼苗生長(zhǎng)過(guò)程的第一真葉期和第二真葉期中，抗壞血酸含量與葉綠素a、類胡蘿卜素含量為正相關(guān)，與葉綠素b含量為負(fù)相關(guān)，所有相關(guān)檢驗(yàn)的P均未達(dá)到顯著性水平。

2.2.3? 抗壞血酸含量與丙二醛含量的相關(guān)關(guān)系? 對(duì)測(cè)定的第一真葉和第二真葉中的抗壞血酸含量與丙二醛含量進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為-0.618，抗壞血酸含量與丙二醛含量為負(fù)相關(guān);P為0.191，相關(guān)不顯著（表2）。

3? 小結(jié)與討論

3.1? 討論

植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)是植物組織的保護(hù)物質(zhì)，可降低組織或者細(xì)胞的冰點(diǎn)，使細(xì)胞的水合度增大，保水能力增強(qiáng)，避免原生質(zhì)在低溫下受到傷害[11]。可溶性蛋白質(zhì)也是植物的滲透調(diào)節(jié)劑之一，蛋白質(zhì)含量增加，降低細(xì)胞的滲透勢(shì)[12，13]。作為一種在植物體內(nèi)具有調(diào)節(jié)和保護(hù)功能的物質(zhì)，目前可溶性蛋白質(zhì)的研究更多地是集中于植物在寒冷、鹽脅迫等逆境中其含量的變化上[11-16]，較少關(guān)注植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中不同階段的含量變化。黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，第一真葉與第二真葉中的可溶性蛋白質(zhì)含量接近，說(shuō)明在黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的早期，不同生長(zhǎng)時(shí)間的真葉葉片中可溶性蛋白質(zhì)含量變化不大。

植物光合作用的基礎(chǔ)是光合色素，各種光合色素含量的不同會(huì)影響植物的光合作用速率[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在黃豆幼苗的功能葉片中，第二真葉的葉綠素a含量高于第一真葉，該結(jié)果與花生幼苗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中功能葉片的結(jié)果是一致的[18]。陽(yáng)生植物中，葉綠素a與葉綠素b的比值大于陰生植物，該比值可以反映植物對(duì)光能的利用程度[19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，第二真葉中的葉綠素a/b大于第一真葉，說(shuō)明第二真葉對(duì)光能的利用率要高于第一真葉。

作為膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，丙二醛含量的高低可以反映細(xì)胞質(zhì)膜過(guò)氧化的程度[20]。植物在生長(zhǎng)過(guò)程中，生成的丙二醛含量可以使葉綠素和蛋白質(zhì)降解，進(jìn)而使植物的葉片凋亡和脫落[21，22]。第二真葉中的丙二醛含量遠(yuǎn)低于第一真葉，說(shuō)明第二真葉的膜脂過(guò)氧化程度遠(yuǎn)低于第一真葉。結(jié)合葉片中可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素含量的結(jié)果，丙二醛對(duì)可溶性蛋白的降解影響更小，而對(duì)光合色素的作用可能會(huì)更大。具體而言，丙二醛可能對(duì)葉綠素a的降解作用更為顯著。

另外，抗壞血酸在清除自身的活性氧和抗氧化方面具有重要的生理功能，類胡蘿卜素也是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑[20]。第二真葉中較高的抗壞血酸和類胡蘿卜素含量可能在植物生長(zhǎng)的早期維持了植物體內(nèi)較低的過(guò)氧化物水平，作為植物體內(nèi)的第一道防線在賦予植物的抗氧化能力上具有重要作用。其內(nèi)在關(guān)系可能是，高抗壞血酸和高類胡蘿卜素含量降低了植物體內(nèi)的O2-·，進(jìn)而降低了植物膜脂的過(guò)氧化水平，降低了丙二醛含量。當(dāng)此作用可以維持植物體內(nèi)較低的丙二醛含量水平時(shí)，植物可以避免合成相關(guān)的過(guò)氧化物酶類，從而維持植物體內(nèi)物質(zhì)和能量流動(dòng)的最佳方向。這也可能是本試驗(yàn)中沒(méi)有測(cè)定出過(guò)氧化物酶活性的內(nèi)在原因。

3.2? 小結(jié)

通過(guò)對(duì)黃豆幼苗生長(zhǎng)發(fā)育早期中第一真葉和第二真葉的部分生理數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可知，第一真葉中較高的丙二醛含量與較低的葉綠素a含量和較高的葉綠素b含量對(duì)應(yīng)，第二真葉中較低的丙二醛含量與較高的葉綠素a含量和較低的葉綠素b含量對(duì)應(yīng)，判斷丙二醛對(duì)葉綠素a具有較大的破壞作用，對(duì)葉綠素b則不具有破壞性，說(shuō)明MDA對(duì)光合色素的破壞具有選擇性;抗壞血酸含量與可溶性蛋白質(zhì)、葉綠素b和丙二醛含量呈負(fù)相關(guān)，與葉綠素a和類胡蘿卜素含量呈正相關(guān)，但相關(guān)均不顯著。

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