李彥樺，李雨珊，張仁靜，周雪梅，何欣蓉

637000 四川 南充，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科(李彥樺、周雪梅、何欣蓉)；610000成都，航空工業(yè)363醫(yī)院 病理科(李彥樺)；637000 四川 南充，川北醫(yī)學(xué)院 病理教研室(李雨珊、張仁靜、周雪梅、何欣蓉)

我國食管癌的發(fā)病率和死亡率均居世界之首，占全球的50%[1]。食管癌高發(fā)于四川省北部的閬中市、鹽亭縣、西充縣，居當(dāng)?shù)匕┌Y發(fā)病率的第一位，而且發(fā)病率有逐年上升的趨向[2]。食管癌的病理類型較多，我國90%的患者為食管鱗狀細胞癌(簡稱食管鱗癌)。近年來，關(guān)于微小RNA(microRNA，miRNA)功能的研究已成惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展機制研究中的熱點。miRNA是一類長度在19～25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子非編碼RNA，廣泛存在于真核生物細胞內(nèi), 具有重要的基因調(diào)節(jié)作用。越來越多的研究表明，多種miRNA在惡性腫瘤中表達異常[3-5]。在食管癌組織中，已發(fā)現(xiàn)上調(diào)的miRNA 有miR-21、miR-let-7c、miR-16、miR-25、miR-155、miR-208、miR-223等；已發(fā)現(xiàn)低表達的miRNA有miR-133a、miR-200b、miR-203、miR-375、miR-625 等[6-9]。本研究通過miRNA芯片技術(shù)方法篩選食管鱗癌相關(guān)的miRNA，利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測差異顯著的miRNA的靶基因，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗證食管鱗癌中miR-181a-5p、miR-320a和TGF-β1mRNA的表達情況，探索其與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材 料

1.1 miRNA芯片雜交標本來源

收集川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科經(jīng)病理確診的食管鱗癌蠟塊及相應(yīng)的瘤旁正常組織(距離腫瘤邊緣﹥5cm)蠟塊各3例，所有患者術(shù)前均未接受放化療治療。本研究由川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準[編號：2016ER(A)024]。

1.2 qRT-PCR標本來源

納入2016年于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受食管癌根治性手術(shù)的患者22例，收集切除的新鮮癌組織及相應(yīng)的瘤旁正常組織(距離腫瘤邊緣>5cm)。22例患者均為男性，年齡50～74歲；其中，高分化10例，中分化11例，低分化1例(由于低分化組數(shù)量太少，分組比較時將其與中分化組合并)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性10例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性12例。所有患者術(shù)前均未接受放化療治療；術(shù)后腫瘤組織病理診斷均為食管鱗狀細胞癌，切緣均未被累及。組織用生理鹽水清洗，以100g為單位分裝于凍存管，裝在冰凍盒中并于-80℃冰箱保存。

2 方 法

2.1 miRNA芯片雜交

實驗樣品RNA采用Agilent miRNA芯片配套的試劑盒，miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(Cat#5190- 0456, Agilent technologies, Santa Clara, CA, US)，按照標準操作流程的標記部分對樣品中的miRNA分子進行熒光標記。miRNA芯片檢測、雜交掃描和數(shù)據(jù)分析均由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

2.2 qRT-PCR

2.2.1 總RNA的提取 應(yīng)用Trizol等試劑提取食管鱗癌及對照正常組織的總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度后于-80℃保存(D260nm/D280nm在1.8～2.0之間)。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測目的miRNA的表達量 使用All-in-One-miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒將組織中提取的RNA逆轉(zhuǎn)率成cDNA，反應(yīng)條件為37℃ 60min,85℃ 5min, cDNA于-20℃冰箱保存；將cDNA稀釋后根據(jù)All-in-One-miRNA qRT-PCR Detection Kit試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR操作，反應(yīng)條件為95℃ 10 sec, Tm-2℃ 20 sec, 72℃ 10sec,40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參，計算CT值，所有反應(yīng)均設(shè)有3個復(fù)孔。miR-320a的正向引物序列為5′-TATTCGCACTGGATACGACTCCAGC-3′，反向引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；miR-181a的正向引物序列為5′-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3′，反向引物序列為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；TGF-β1的正向引物序列為5′-AATACGTCAGACTTCGGGAAGCA-3′，反向引物序列為5′-GTCAATGTACAGCTGCCGTACACA-3′；U6的正向引物序列為5′-CGCTTCGGCAGCACATATA-3′，反向引物序列為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2.3 數(shù)據(jù)分析

2.3.1 芯片數(shù)據(jù)分析 (1)差異表達miRNA的篩選：雜交后的芯片經(jīng)過統(tǒng)計分析及處理以后，癌組織與對照正常組織進行對比, 以差異倍數(shù)在兩倍或者兩倍以上為標準，將滿足差異倍數(shù)大于2的miRNA識別為差異表達的miRNA；(2)miRNA靶基因預(yù)測：采用數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRBase進行靶基因預(yù)測；(3)miRNA靶基因的功能和通路富集分析：分別使用Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫和KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫對差異表達miRNA調(diào)控的靶基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，利用Fisher精確檢驗和多重比較檢驗計算每個功能的顯著性水平(P值)，顯著性的GO和通路條目的篩選的標準為校正后的P值小于0.05。

2.3.2 qRT-PCR數(shù)據(jù)分析 根據(jù)Livak法計算表達倍數(shù)：2-[CT腫瘤組(目的基因-內(nèi)參基因)-CT對照正常組織組(目的基因-內(nèi)參基因)]

2.4 統(tǒng)計方法

所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均用SPSS 17.0軟件分析完成。以P﹤0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較采用t檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 miRNA芯片檢測結(jié)果

雜交后的芯片經(jīng)過統(tǒng)計分析及處理后，共篩選出22種miRNA存在差異表達。其中上調(diào)大于2倍的miRNA有6種：miR-181a-5p、miR-21-3p、miR-370-3p、miR- 4746-3p、miR-664b-5p、miR-6807-5p。下調(diào)差異的miRNA有16種：miR-1260a、miR-133a-3p、miR-30a-3p、miR-30e-3p、miR-320a、miR-320b、miR-320d、miR-320e、miR-338-3p、miR-361-5p、miR-378a-3p、miR-378i、miR- 4328、miR- 4770、miR- 497-5p、miR-551b-3p(表1)。

表1 食管鱗癌中表達差異的miRNAs

Table 1. Differentially Expressed miRNAs in Esophageal Squamous Cell Carcinoma

miRNAup-regulatedFoldchangemiRNAdown-regulatedFoldchangehsa-miR-181a-5p2.39hsa-miR-1260a0.42hsa-miR-21-3p4.32hsa-miR-133a-3p0.05hsa-miR-3702.25hsa-miR-30a-3p0.14hsa-miR-4746-3p2.04hsa-miR-30e-3p0.22hsa-miR-664b-5p3.73hsa-miR-320a0.44hsa-miR-6807-5p2.09hsa-miR-320b0.44hsa-miR-320d0.41hsa-miR-320e0.38hsa-miR-338-3p0.18hsa-miR-361-5p0.41hsa-miR-378a-3p0.28hsa-miR-378i0.24hsa-miR-43280.28hsa-miR-47700.33hsa-miR-497-5p0.44hsa-miR-551b-3p0.35

3.2 差異表達miRNA的靶基因預(yù)測

通過數(shù)據(jù)庫TargetScan、miRBase發(fā)現(xiàn)，每種差異表達的miRNA都參與了多個預(yù)測靶基因的調(diào)控(表2)。這些結(jié)果表明食管鱗癌相關(guān)miRNA作用靶點廣泛，且多個miRNA可共同調(diào)控部分靶基因。

表2 差異表達miRNAs的靶基因預(yù)測數(shù)

Table 2. Number of Differentially Expressed miRNA-regulated Target Genes

miRNANumberofpredictedtargetgeneshsa-miR-181a-5p679hsa-miR-21-3p469hsa-miR-37024hsa-miR-4746-3p592hsa-miR-664b-5p1224hsa-miR-6807-5p547hsa-miR-1260a1777hsa-miR-133a-3p16hsa-miR-30a-3p587hsa-miR-30e-3p203hsa-miR-320a563hsa-miR-320b94hsa-miR-320d29hsa-miR-320e1303hsa-miR-338-3p1149hsa-miR-361-5p903hsa-miR-378a-3p383hsa-miR-378i8hsa-miR-4328816hsa-miR-4770405hsa-miR-497-5p229hsa-miR-551b-3p29

3.3 差異表達miRNA的靶基因的生物學(xué)功能分析

為了進一步了解差異表達miRNA的生物學(xué)意義，對預(yù)測得到的靶基因進行GO功能分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)激酶功能、受體功能、轉(zhuǎn)錄因子功能等是最顯著富集的基因功能(圖1)，Toll樣受體信號通路、多能干細胞調(diào)控信號通路、TGF-β信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解等信號通路是富集最顯著的信號通路(圖2)。

3.4 qRT-PCR檢測結(jié)果

3.4.1 miR-181a-5p、miR-320a的表達 從差異表達的miRNA中，即表達升高和下降中各挑選1個miRNA(miR-181a-5p、miR-320a)行qRT-PCR檢驗，其結(jié)果與芯片結(jié)果相符合：miR-181a-5p在癌組織中表達比對照正常組織高，miR-320a在癌組織中表達比對照正常組織低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖1 靶基因功能富集的前30種

Figure 1. Top 30 GO Enrichment

圖2 靶基因富集信號通路的前30種

Figure 2. Top 30 Pathways Enrichment

圖3 miR-181a-5p、miR-320a在癌組織和正常組織中的相對表達倍數(shù)

Figure 3. Expression of miR-181a-5p and miR-320a in Normal Tissue and Cancer Tissue

3.4.2 TGF-β1mRNA的表達 在對miR-181a-5p、miR-320a的靶基因和信號通路的預(yù)測中，發(fā)現(xiàn)TGF-β可能是兩者共同的目標通路，因此采用qRT-PCR檢測TGF-β1，發(fā)現(xiàn)TGF-β1mRNA在食管鱗癌中表達較對照正常組織中稍升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.067)(圖4)。使用線性相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p與TGF-β1mRNA之間、miR-320a與TGF-β1mRNA之間不存在線性關(guān)系(P=0.451，P=0.173)。

3.4.3 miR-181a-5p、miR-320a表達與食管鱗癌臨床病理特征中的關(guān)系 22例食管鱗癌根據(jù)年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤深度、臨床分期進行分組，分析miR-181a-5p、miR-320a與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤深度、臨床分期的關(guān)系。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明miR-181a-5p的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者miR-181a-5p的表達更高，說明高表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率更大;但miR-181a-5p的表達與分化程度、年齡、浸潤深度、臨床分期均無關(guān)(P﹥0.05)。miR-320a的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、年齡、浸潤深度、臨床分期均無關(guān)(P﹥0.05)(表3)。

圖4 TGF-β1 mRNA在癌組織和對照正常組織的表達倍數(shù)

Figure 4. Expression of TGF-β1 in Normal Tissue and Cancer Tissue

表3 miR-181a-5p、miR-320a與臨床病理特征的相關(guān)性

Table 3. Correlation between miR-181-5p/miR-320a and Clinicopathological Features

ClinicopathologicaldataCases(n)miR-181a-5pCTPmiR-320aCTPNumberofcases22Age0.1860.609 ≤64121.663.62 >64102.254.07Degreeofdifferentiation0.7210.180 Moderately-lowdifferentiated121.853.31 Highlydifferentiated102.024.44Lymphaticmetastasis0.0260.257 Positive101.433.32 Negative122.334.25Depthofinvasion Muscularlayer121.980.7082.290.671 Thewholeesophagealwall102.202.56TNMstaging 121.110.6503.330.757 2201.383.56

4 討 論

目前食管癌的診斷主要依靠內(nèi)鏡與病理活檢，檢出率雖高，但食管癌本身癥狀隱匿，并且內(nèi)鏡存在適應(yīng)范圍限制，80%以上患者確診時已進入中晚期，5年生存率僅為10%～30%[10]。miRNA主要通過與靶mRNA 的 3’UTR 序列互補結(jié)合而抑制靶mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)表達。相比蛋白質(zhì)表達，miRNA表達作為標記物更為靈敏，而且具有高度保守性、時序性和組織特異性，使其成為最具希望的潛在分子診斷和治療靶標。

miRNA芯片技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種快速有效的分析miRNA表達譜的方法，本研究先應(yīng)用miRNA芯片技術(shù)對食管癌組織的miRNA表達譜進行研究，發(fā)現(xiàn)了22個差異表達的miRNA，其中6個顯著上調(diào)，16個顯著下調(diào)。

Komatsu等[11]研究在食管鱗癌患者血漿中發(fā)現(xiàn)兩種miRNA的聯(lián)合檢測比單一miRNA檢測率高。Lou等[12]研究發(fā)現(xiàn)，通過溶瘤腺病毒共表達miR-34a及IL-24能夠發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a-5p在食管癌、胃癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤等多種腫瘤中表達升高[13-17]，miR-320a在口腔癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種腫瘤中表達下降[18-22]，但miR-181a-5p和miR-320a在食管癌中的同時表達情況目前沒有報道，故本研究將其作為進一步研究目標。miRNA芯片特異性及靈敏度不高，因此本研究采用具有較高的靈敏度及特異性qRT-PCR實驗進行驗證。研究發(fā)現(xiàn)癌組織中miR-181a-5p高于對照正常組織，癌組織中miR-320a低于對照正常組織，與芯片結(jié)果相符合，說明miR-181a-5p及miR-320a的異常表達可能與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。結(jié)合病例分析，miR-181a-5p的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且高表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率更高，但與分化程度、年齡、浸潤深度、臨床分期的關(guān)系均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。miR-320a的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、年齡、浸潤深度、臨床分期的關(guān)系均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。以后的實驗中將擴大樣本量以及采用分子生物學(xué)技術(shù)，研究miR-181a對食管癌轉(zhuǎn)移的影響。

近年來，越來越多的研究表明，miRNA通過控制腫瘤抑制基因或致癌基因的表達，調(diào)控著腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[23-25]，但所涉及的關(guān)鍵基因和信號通路目前還不清楚。本文應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測差異顯著的miR-181a-5p和miR-320a的靶基因和信號通路，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子β可能是兩者共同作用的目標通路。本研究采用qRT-PCR對其進行了初步分析，發(fā)現(xiàn)TGF-β1mRNA在食管鱗癌中升高，提示TGF-β1可能為miR-181a-5p和miR-320a調(diào)控的靶基因，但其癌組織與癌旁正常組織中的表達差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.067)。分析原因可能有以下3點：1.miR-181a和miR-320a影響TGF-β1翻譯，對于TGF-β1mRNA無明顯影響；2.病例數(shù)較少，統(tǒng)計數(shù)據(jù)欠準確；3.miR-181a-5p、miR-320a與TGF-β1無直接相關(guān)，但通過其它基因和信號通路相互作用，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在以后的研究中，擬采用雙熒光素酶報告基因驗證TGF-β1是否為miR-181a-5p和miR-320a共同的靶基因，在細胞實驗中采用分子生物學(xué)技術(shù)研究miR-181a-5p和miR-320a功能及機制，為食管癌的發(fā)病機制與診斷研究提供新的思路。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。