黃夢璐， 王 潔， 王 磊

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007）

魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)對于魚類種質(zhì)資源保存、遺傳多樣性保護、新品種選育等均具有重要意義。利用這一技術(shù)建立冷凍精子庫，可以解決雌雄發(fā)育不同步和遠距離不同物種間雜交等難題。20世紀(jì)50年代，英國學(xué)者Blaxter等[1]首次冷凍保存了大西洋鮭的精子，并且獲得了80%的受精率。我國的魚類精子冷凍保存研究開始于20世紀(jì)50年代，到目前為止，我國研究人員先后成功保存了江鱈(Lota lota)[2]、刀鱭(Coilia ectenes)[3]、美洲鰣魚(Alosa sapidissima)[4]、小黃魚 (Larimichthys polyactis)[5]、哲羅鮭(Hucho taimen)[6]和雙斑東方鲀(Takifugu bimaculatus)[7]等魚類精子。但是，目前這一技術(shù)仍面臨許多問題，一方面，精子冷凍保存的最適稀釋液及濃度、最適抗凍劑及濃度等篩選步驟較繁瑣，缺少自動化篩選儀器；另一方面，魚類精子冷凍保存效果的評價體系有待完善。為解決上述問題，本文分析了超低溫保存魚類精子的相關(guān)報道，并進行了歸納總結(jié)，以期為后續(xù)的相關(guān)研究提供一定的理論指導(dǎo)。

1 稀釋液

稀釋液可以為精子提供適宜的存活環(huán)境、營養(yǎng)，同時還可以降低抗凍劑對精子的毒害作用。近年來，我國學(xué)者對鰈形目、鯰形目和鯉形目等魚類進行了精子冷凍保存實驗（表1），其中應(yīng)用較多的稀釋液有Hank’s 鹽溶液（HBSS）和D-15，其次是魚用任氏液，而Ringer液、MPRS和D-17等應(yīng)用較少。研究發(fā)現(xiàn)，Hank’s鹽溶液較適用于鱸形目魚類精子的保存，D-15或D-15改良液適用于鯉形目魚類精子的保存。

表1 魚類精子冷凍保存常用的稀釋液、抗凍劑和稀釋比例Tab1 The dilute solution, cryopretectant and dilution rate of fish sprm commonly used in cryopreservation

續(xù)表

2 抗凍劑

抗凍劑可以減少冰晶對精子結(jié)構(gòu)的損傷，延長精子的壽命。目前常用的抗凍劑為滲透性抗凍劑，如二甲基亞砜（DMSO）、甲醇（MeOH）、丙二醇（PG）、乙二醇（EG）、甘油（Gly）等。近年來，我國學(xué)者在進行魚類精子超低溫冷凍實驗時對抗凍劑的使用情況如表1所示，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)最常用的抗凍劑為DMSO，濃度約為5%～15%[16,23]；其次是EG，濃度約在為5%～20%[22]，也可按照一定比例合用兩種或兩種以上的抗凍劑。總之，魚類精子冷凍保存時，鰈形目使用DMSO作為抗凍劑較多[20,24,26]；鯰形目使用MeOH作為抗凍劑較多[16]；鯉形目使用DMSO[3,18]和EG[29]較多；鱸形目的魚類沒有特定的抗凍劑選擇偏向，其他魚類因數(shù)據(jù)較少，暫不能做出關(guān)于相關(guān)判斷。此外，在配制保護液時可以加入添加劑，最常見的添加劑有二糖、維生素和蛋黃等。如在保存太平洋鱈(Gadus macrocephalus)[33]精子的保護液中添加了12%的丙二醇和10%的蛋黃。

3 冷凍程序

目前最常用的冷凍方法有程序降溫法、二步法和三步法，也有不經(jīng)降溫直接冷凍的，冷凍方法一般遵循慢凍速融的原則，關(guān)鍵是尋找最佳降溫速率。不同種魚類精子適宜的降溫速率（高度）有所不同，若精子在冷凍過程中胞內(nèi)外水的進出達到平衡，則獲得的冷凍效果最好。近年來，我國學(xué)者在多種魚類中均找到了適宜的降溫方法。其中二步法[8,12,16-18]是被應(yīng)用最多的冷凍方法，其次是三步法[3,4,7,16,21,25,26]和程序降溫法[5,33]。鰈形目[24,25]、鯡形目[3,4]、鲀科[7]大都用三步法冷凍精子，鯉形目[17]大都用二步法冷凍精子。

4 解凍方法

解凍可分為室溫解凍和水浴解凍，目前常用的方法為水浴解凍。近年來我國學(xué)者探索了多種魚類解凍的方法，例如：鲀吻黃蓋鰈精子先從冷凍管中取出，平衡1 min 后迅速投入37 ℃水浴鍋中搖晃解凍[25]；點帶石斑魚精子在液氮蒸汽中平衡10 min 后，直接放入40 ℃水浴至完全融解[21]；刀鱭精子在液氮口平衡5 min后，在37 ℃水浴中解凍[3]；興國紅鯉精子在37 ℃水浴條件下解凍100 s[8]；西伯利亞鱘精子在40 ℃水浴條件下解凍[9]；光唇魚精子[17]和翹嘴鱖精子[16]在37 ℃條件下水浴解凍。

展望

魚類精子超低溫冷凍保存不僅有利于魚類精子庫和種質(zhì)資源庫的建立，而且可以為魚類的遺傳育種工作提供技術(shù)支持。但是目前為止，超低溫冷凍保存魚類精子依然存在許多技術(shù)瓶頸：一是由于魚類種類較多，每種魚類精子的最適保存條件各異，這加大了精子凍存的難度，也制約了超低溫冷凍保存技術(shù)發(fā)展；二是配子質(zhì)量評價系統(tǒng)不完善，對精子的質(zhì)量評估無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

為了解決以上問題，今后可以從以下幾個方面加大研究：一方面建立操作標(biāo)準(zhǔn)。可首先從每個科中篩選1種具有代表性的魚類建立冷凍保存技術(shù)，此科中的其他魚類可以參照該標(biāo)準(zhǔn)進行摸索，從而減少探索新物種精子冷凍保存的時間；另一方面參考人類的精子評估體系建立通用的配子質(zhì)量評估體系。例如使用CASA (Computer-aided sperm analysis) 系統(tǒng)檢測平均直線速度、平均曲線速度、平路徑速度等。相信隨著不同科中代表性魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)和精子檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的建立，魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)必將取得快速的發(fā)展。