劉美琪 衛(wèi)東鋒 馬濤 任建廷

摘要：目的? 觀察天芪益智顆粒對阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）大鼠學習記憶能力和皮層、海馬組織蛋白質組的影響，探討其分子作用機制。方法? 將實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、陽性藥組和天芪益智顆粒高、中、低劑量組，每組12只。灌胃給藥，每日1次，連續(xù)40 d。給藥結束后，采用Morris水迷宮實驗評價大鼠學習記憶能力，應用TMT蛋白質組學方法進行質譜分析，確定天芪益智顆粒組與模型組間的差異蛋白質，應用PANTHER及STRING軟件對差異蛋白進行生物信息學分析，采用Western blot對蘋果酸脫氫酶和Fas相關的死亡結構域蛋白的表達變化進行驗證。結果? 水迷宮實驗結果顯示，與模型組比較，天芪益智顆粒高、中劑量組定位巡航實驗中逃避潛伏期縮短，空間探索實驗中穿越目標區(qū)域次數(shù)顯著增加（P<0.05，P<0.01）;蛋白質組學結果顯示，天芪益智顆粒高劑量組中成功鑒定33個差異蛋白質，這些蛋白及網(wǎng)絡的功能涉及能量代謝、神經(jīng)傳遞、細胞凋亡、細胞骨架、神經(jīng)營養(yǎng)等，且Western blot蛋白表達檢測結果與蛋白質組學結果一致。結論? 天芪益智顆?？擅黠@改善AD大鼠學習記憶能力，其機制與調節(jié)能量代謝、神經(jīng)傳遞、細胞凋亡、細胞骨架及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的表達密切相關。

關鍵詞：天芪益智顆粒;阿爾茨海默病;學習記憶能力;蛋白質組學;能量代謝;大鼠

中圖分類號：R285.5??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：1005-5304（2019）06-0042-09

Abstract： Objective To observe the effects of Tianqi Yizhi Granules on learning and memory ability and proteomics in cerebral cortex and hippocampus of AD rats; To explore the molecular mechanism of Tianqi Yizhi Granules. Methods SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Tianqi Yizhi Granules high-， medium-， and low-dosage groups， with 12 rats in each group. The rats received gavage for medication， once a day for 40 d. After the end of the administration， Morris water maze test was used to evaluate the effects of medicine on the learning and memory ability of the rats. The TMT proteomics method was used for mass spectrometry todetermine the differential proteins between Tianqi Yizhi Granules groups and model group. Bioinformatics analysis of differential proteins was performed by using PANTHER and STRING software， and the expression changes of malate dehydrogenase and Fas-associated death domain protein were verified by Western blot. Results Morris water maze experiment showed that the escape latency of Tianqi Yizhi Granules high- and medium-dosage groups were shortened and the times of crossing target quadrant in space exploration experiment significantly increased （P<0.05， P<0.01） compared with model group. Proteomics results showed that there were 33 differentially expressed proteins between model and Tianqi Yizhi Granules groups. The functions of these proteins and protein network were related to energy metabolism， neurotransmission， cell apoptosis， cytoskeleton and neurotrophy. The Western blot results of malate dehydrogenase and FAS-associated death domain protein were consistent with proteomics results. Conclusion Tianqi Yizhi Granules can improve learning and memory ability of AD rats and the action of mechanism is closely related to the regulation of protein expression of energy metabolism， neurotransmission， apoptosis， cytoskeleton and neurotrophin.

Keywords： Tianqi Yizhi Granules; Alzheimer disease; learning and memory ability; proteomics; energy metabolism; rats

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種神經(jīng)退行性疾病，以記憶障礙、失用、失認、視空間損害、執(zhí)行功能障礙及人格、行為異常為主要臨床表現(xiàn)，主要病理表現(xiàn)包括腦萎縮、β-淀粉樣蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）沉積、神經(jīng)原纖維纏結、神經(jīng)元及突觸丟失[1]。2000-2013年，AD死亡人數(shù)增加71%[2]，目前全球已有4680萬人患有AD，預計到2050年將增加到1.315億[3]，AD防治的全球成本已占全球GDP的0.65%[4]。因此，尋找抗AD新藥，減輕患者醫(yī)療和家庭負擔是目前迫切需要解決的問題之一。Aβ級聯(lián)反應和Tau蛋白磷酸化是AD主要病理表現(xiàn)[5]，Aβ是AD生物標志物之一，可引發(fā)一系列氧化應激及炎癥反應，最終導致神經(jīng)元死亡[6-7]。

臨床上目前使用的抗AD藥物大多針對AD某一病理環(huán)節(jié)起作用，不良反應大、費用昂貴，而中醫(yī)藥在防治AD方面積累了豐富的臨床經(jīng)驗，具有一定的潛在優(yōu)勢和研發(fā)價值[8-10]。天芪益智顆粒由紅景天提取物和紅芪提取物組成，主要有效成分為紅景天苷和紅芪多糖，二者均有一定的神經(jīng)保護和抗氧化作用。本研究采用Aβ1-42腦內(nèi)注射法建立AD大鼠模型，應用Morris水迷宮實驗評價天芪益智顆粒的認知改善作用，采用TMT蛋白質組學方法分析藥物影響的差異蛋白質，采用Western blot方法進行驗證，并對差異蛋白質進行生物信息學分析，從蛋白分子水平探討天芪益智顆粒的作用機制。

1? 實驗材料

1.1? 動物

雄性SPF級SD大鼠72只，4月齡，體質量250～300 g，中國食品藥品檢定研究院提供，動物許可證號SCXK（京）2014-0013。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物實驗室，溫度（24±2）℃，相對濕度（50±10）%，自由攝食飲水，12 h/12 h明暗交替。實驗程序根據(jù)NIH《實驗動物的護理和使用指南》進行，該程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院動物護理和使用委員會審查批準。

1.2? 藥物

天芪益智顆粒，北京中醫(yī)藥大學藥學院，批號20140913;石杉堿甲片，河南太龍藥業(yè)有限公司，批號140910A。

1.3? 主要試劑與儀器

Aβ1-42（美國Sigma-Aldrich），TMT sixplex Label Reagent Set（美國Thermo Scientific Pierce），兔抗Mdh2（Cell Signaling Technology，#8610），兔抗Fadd （Abcam，ab124812），小鼠抗β-actin（Santa Cruz，sc-47778），山羊抗小鼠IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2302），山羊抗兔IgG-HRP（Santa Cruz，sc-2004），RIPA裂解液（Roche Diagnostics），ECL試劑盒（Amersham Pharmacia Biotech）。Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（中國醫(yī)學科學院藥物研究所，DMS-2），渦旋振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），酶標儀（Thermo，Multiskan MK3），RIGOL L-3000高效液相色譜系統(tǒng)（北京普源精電科技有限公司），GeneGnomeXRQ生物成像系統(tǒng)（Syngene），高效液相色譜儀（Thermo Scientic EASY-nLC 1000 System，Nano HPLC），質譜系統(tǒng)（Thermo，Q-Exactive）。

2? 實驗方法

2.1? 分組

將實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組、陽性藥組和天芪益智顆粒高、中、低劑量組，每組12只。

2.2? 造模

參考文獻[11]方法，采用Aβ1-42微量注射法建立AD大鼠模型。操作步驟：將Aβ1-42溶解在六氟異丙醇中至終濃度4 μg/μL，4 ℃孵育48 h形成Aβ1-42寡聚體。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，使用立體定向儀固定頭部，對手術區(qū)域消毒，在顱骨中部縱向切口以暴露顱骨。分離骨膜后暴露頭骨，于前囟后3 mm、中線旁開2.2 mm處，用牙科鉆打開顱骨，使用微量進樣器垂直進針3 mm，將Aβ1-42寡聚體溶液緩慢注入兩側海馬，注射時間5 min，留針5 min。假手術組注射等體積無菌生理鹽水。

2.3? 給藥

造模后6 d開始給藥，天芪益智顆粒高、中、低劑量組分別給予0.76、0.38、0.19 g/kg天芪益智顆粒藥液灌胃，陽性藥組給予0.02 mg/kg石杉堿甲灌胃，假手術組和模型組給予等量無菌生理鹽水灌胃。給藥體積均為0.5 mL/100 g，每日1次，連續(xù)40 d。

2.4? Morris水迷宮實驗

采用Morris水迷宮實驗評價各組大鼠空間學習和記憶能力。水迷宮由圓形水池、可移動平臺和圖像采集分析系統(tǒng)組成。實驗前1 d，將大鼠置于平臺30 s后使其入水，自由游泳60 s后，將其再次置于平臺30 s。首先進行可視平臺測試，平臺位于目標象限并使其頂部高于水面2 cm，記錄大鼠找到平臺的逃避潛伏期和總路程。定位巡航實驗：目標象限為第一象限，平臺位于水面下2 cm，實驗連續(xù)5 d，大鼠從除目標象限外的任一點入水，測定大鼠找到平臺的逃避潛伏期?？臻g探索實驗：撤去平臺，將大鼠從除目標象限外的任一象限入水，測定大鼠穿越目標象限的次數(shù)，記錄其在目標象限的停留時間。

2.5? TMT蛋白質組學分析

2.5.1? 樣品蛋白提取及胰酶酶解

水迷宮實驗結束后，模型組和天芪益智顆粒高劑量組大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉并處死，冰上快速分離腦組織，用預冷的生理鹽水沖洗干凈。每組分別隨機選取3只大鼠腦組織，將皮層和海馬組織樣本中加入適量裂解液（8 mol/L尿素，100 mmol/L Tris，1×蛋白酶抑制劑，pH 8.5）中，渦旋混勻，超聲破碎5 min，使蛋白完全溶解，蛋白懸浮液4 ℃、15 000×g離心10 min，取上清分裝后凍存于-80 ℃冰箱。采用Bradford法測定蛋白溶液的蛋白濃度。使用胰蛋白酶進行蛋白酶切，將酶切樣品溶液加入脫鹽柱中進行脫鹽處理。

2.5.2? TMT標記

各組蛋白樣品脫鹽后，使用TMT標記試劑盒進行標記。標記的樣品是大鼠的腦組織，從每組中隨機選擇3只大鼠進行生物學復制，將所有大鼠腦組織樣品混合，用作重復實驗的內(nèi)標。將TEAB緩沖液、TMT標簽和干粉狀態(tài)下的樣品從-20 ℃轉移至室溫下平衡。制備100 mmol/L TEAB溶液。將單個樣品（不超過100 μg/TMT標簽）溶于TEAB緩沖液，充分混勻，放置10 min。每個TMT試劑瓶中加入不高于100 μL蛋白樣品溶液，渦旋振蕩，孵育1 h，向每個瓶中加入5%羥胺8 μL終止反應，孵育15 min。標記結束后，立即將蛋白樣品真空凍干，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3? 肽段混合及LC-MS/MS檢測

將混合標記后的樣品用100 μL乙腈流動相溶液溶解，14 000×g離心20 min，取上清液，在高pH條件下進行反相色譜梯度分離。將分離得到的組分用2%乙腈+0.1%甲酸20 μL復溶。12 000×g離心10 min，吸取上清液，采用夾心法上樣，上樣體積10 μL。

質譜分析時，噴霧電壓為2.41 kV，毛細管溫度為25 ℃，離子源為EASY-噴霧源，一級全掃掃描范圍為350～1600 m/z，分辨率為70 000 FWHM，掃描時間為60 ms，二級圖譜掃描范圍為350～1600 m/z，分辨率為17 500 FWHM，掃描時間為70 ms。

2.5.4? 質譜數(shù)據(jù)分析

質譜分析由Thermo Q-Exactive型質譜系統(tǒng)完成，產(chǎn)生的質譜原始文件采用Thermo公司的配套軟件Proteome Discoverer進行處理。數(shù)據(jù)庫的選擇以所需物種、數(shù)據(jù)庫注釋完備性及序列可靠性為參考依據(jù)，使用UNIPROT Rat數(shù)據(jù)庫，靜態(tài)修飾選擇甲酰胺甲基化修飾，動態(tài)修飾選擇氧化修飾。對組間原始數(shù)據(jù)的ratio進行過濾后，進行t檢驗，確定差異表達的蛋白質，進行下一步分析。

2.6? 生物信息學分析

2.6.1? GO分析

將差異蛋白質編號上傳至PANTHER分類系統(tǒng)網(wǎng)站（http：//www.pantherdb.org）進行GO功能注釋分析，通過檢索分析，得出差異蛋白的分子功能、生理學過程、亞細胞定位及信號通路分類結果，并得出參與細胞各種功能的蛋白質數(shù)目，從整體上把握蛋白質與分子功能之間的相關性，提示與疾病及藥物高度相關的蛋白質分子，分析藥物的作用特征[12]。

2.6.2? 蛋白質相互作用網(wǎng)絡分析

STRING是ELIXIR的核心數(shù)據(jù)資源之一，是收載已知或預測蛋白質相互作用（PPI）的數(shù)據(jù)庫。在STRING中添加需要計算分析的蛋白質，以創(chuàng)建PPI網(wǎng)絡。將差異蛋白質編號信息上傳至蛋白網(wǎng)絡在線分析系統(tǒng)STRING10.5進行PPI分析，分析得出藥物對差異蛋白網(wǎng)絡影響的特征[13]。

2.7? Western blot檢測蛋白表達

每組隨機選取3只大鼠，取皮層、海馬組織，在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中冰上勻漿，4 ℃、15 000×g離心20 min，用BCA法測定上清液蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離等量蛋白質，電泳轉移至預先用100%甲醇處理的PVDF膜，將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的PBST緩沖液中封閉1.2 h。4 ℃將膜與用含有5%脫脂奶粉的PBST緩沖液稀釋兔抗Mdh2（1∶1000）、兔抗Fadd（1∶1000）和小鼠抗β-actin（1∶5000）孵育過夜。辣根過氧化物酶綴合抗兔二抗（1∶5000）和抗小鼠二抗（1∶2000）檢測。最后用ECL化學發(fā)光試劑在GeneGnomeXRQ生物成像系統(tǒng)中曝光條帶，使用Image J軟件分析圖像。

3? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示，Morris水迷宮實驗中定位巡航實驗結果使用雙因素重復測量方差分析，空間探索實驗結果使用方差分析比較組間差異;蛋白質定量分析使用Student's t檢驗進行組間差異分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4? 結果

4.1? 天芪益智顆粒對Morris水迷宮實驗模型大鼠學習記憶能力的影響

定位巡航實驗：隨訓練時間的延長，各組大鼠逃避潛伏期均縮短。第3～5日，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組和天芪益智顆粒高、中、低劑量組大鼠逃避潛伏期縮短，部分時點差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。見表1?？臻g探索實驗：與假手術組比較，模型組大鼠在目標象限停留時間百分比和穿越目標象限次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）;與模型組比較，陽性藥組和天芪益智顆粒高、中劑量組大鼠在目標象限停留時間百分比和穿越目標象限次數(shù)均顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。見表2。

4.2? 蛋白質組差異蛋白鑒定結果

經(jīng)LC-MS/MS檢測分析、蛋白數(shù)據(jù)庫檢索及組間差異比較，成功鑒定出33個天芪益智顆粒高劑量組與模型組差異蛋白質，詳見表3。這些差異蛋白的功能與能量代謝、神經(jīng)信號傳遞、神經(jīng)營養(yǎng)、細胞凋亡、蛋白質運輸、細胞骨架等腦神經(jīng)細胞生理、病理過程密切相關，其細胞定位包括線粒體、細胞膜、細胞質、細胞核、髓鞘、細胞骨架、內(nèi)質網(wǎng)等部位，詳見表4。

4.3? 差異蛋白GO功能分類結果

GO分類結果顯示，這些差異蛋白分子功能涉及蛋白結合活性、催化活性、受體活性、信號傳導活性、結構分子活性、轉運活性（見圖1A）;生物學過程涉及生物調節(jié)、生物合成、細胞過程、發(fā)育過程、細胞定位、代謝過程、應激反應等（見圖1B）;細胞組分包括大分子復合物、細胞膜、細胞器等（見圖1C）;信號通路涉及ATP合成、凋亡信號通路、RhoGTP酶對細胞骨架的調控、Fas信號通路、谷氨酰胺-谷氨酸轉化通路、糖酵解、三羧酸循環(huán)信號通路等（見圖1D）。

4.4? 差異蛋白蛋白質相互作用分析結果

所有差異蛋白質構成了一個蛋白調控拓撲網(wǎng)絡，34個蛋白間有相互作用關系，拓撲網(wǎng)絡中包含4個子網(wǎng)絡：紅色子網(wǎng)絡團與線粒體三羧酸循環(huán)相關，丙酮酸脫氫酶Pdha1為關鍵節(jié)點蛋白;綠色子網(wǎng)絡與線粒體膜呼吸鏈代謝相關，NADH脫氫酶鐵硫蛋白2為關鍵節(jié)點蛋白;黃色子網(wǎng)絡與ATP能量代謝相關，ATP合成酶Atp5h為關鍵節(jié)點蛋白;藍色子網(wǎng)絡與蛋白質合成相關。Atp5c1、Atp5d、Pdha1、Atp5o、LOC685778、Dlat和Cyc1是調控網(wǎng)絡中預測的相關蛋白質，見圖2。

4.5? Western blot檢測結果

與對照組比較，模型組大鼠蘋果酸脫氫酶（Mdh2）和Fas相關的死亡結構域蛋白（Fadd）表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，天芪益智顆粒高劑量組大鼠Mdh2和Fadd表達均顯著上調，天芪益智顆粒中劑量組大鼠Fadd表達明顯上調，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖3。該結果與TMT蛋白質組學分析結果一致。

5? 討論

紅景天和紅芪均為生長于高海拔、寒冷地區(qū)的中藥，具有較強的抗氧化和神經(jīng)保護作用。紅景天苷是一種苯丙素苷，具有神經(jīng)保護、緩解Aβ誘導的神經(jīng)毒性、抑制氧化損傷和神經(jīng)元凋亡等作用[14]。紅芪多糖具有明顯的抗氧化、免疫調節(jié)、神經(jīng)保護、抗炎癥反應等藥理作用[15]。Morris水迷宮實驗結果表明，天芪益智顆粒對AD大鼠學習記憶能力具有明顯改善作用;TMT蛋白質組學分析結果表明，天芪益智顆粒能調節(jié)AD大鼠皮層和海馬組織33個蛋白質的表達水平;Western blot檢測結果表明，差異蛋白Mdh2和Fadd的表達變化與TMT蛋白質組學分析結果一致。

已有研究表明，AD患者學習記憶能力下降及其他神經(jīng)功能障礙與神經(jīng)細胞線粒體能量代謝紊亂、炎癥反應、氧化應激、信號轉導、細胞骨架、蛋白轉運及細胞凋亡密切相關[16]。大腦能量代謝被認為是大腦功能障礙的敏感指標，其中線粒體能量代謝異常是線粒體損傷的主要原因之一，包括三羧酸循環(huán)或氧化性呼吸鏈的異常。線粒體級聯(lián)假說認為，當細胞線粒體損傷達到一定閾值時將引起AD患者腦組織的病理變化[17]。本實驗結果表明，天芪益智顆粒高劑量組能上調AD大鼠腦組織能量代謝蛋白包括ATP合成酶、ADP/ATP轉位酶、NADH脫氫酶泛醌復合物Ⅰ、NADH脫氫酶泛醌黃素蛋白2、丙酮酸脫氫酶（乙酰基轉移）激酶同工酶、線粒體丙酮酸載體蛋白2、Mdh2、線粒體鈣離子轉運體、γ-烯醇酶，增強神經(jīng)信號轉導蛋白谷氨酸脫氫酶1、神經(jīng)素蛋白的表達，藥物可明顯增強細胞骨架蛋白Stathmin及微管相關蛋白RP/EB家族成員3、Torsin-1A蛋白的表達，從而發(fā)揮認知改善和神經(jīng)保護作用。

綜上所述，天芪益智顆粒能明顯改善AD大鼠學習記憶能力，對AD大鼠皮層和海馬組織中33個蛋白的表達有明顯調節(jié)作用，表明藥物對AD大鼠腦神經(jīng)細胞的能量代謝、氧化應激、信號轉導及細胞骨架蛋白表達具有明顯調節(jié)作用，這些蛋白可能是藥物作用的蛋白靶標，值得進一步深入研究藥物有效成分與這些蛋白靶標的結合能力，以及對相關信號通路蛋白的影響，為天芪益智顆粒的臨床應用和作用機制研究提供依據(jù)，同時也為該藥的新藥研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

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（收稿日期：2019-02-27）

（修回日期：2019-03-09;編輯：華強）