魯悅新 石紅杰 歐陽珊 孔祥杰 胡宇峰 姬燕曉 李紅良

病理性心肌肥厚是心力衰竭和猝死發(fā)生的重要原因[1]，引起心肌肥厚的原因很多，臨床上主要受遺傳因素、高血壓、內(nèi)分泌、生活習(xí)慣等復(fù)雜因素共同影響。其中高血壓是臨床常見的心肌肥厚誘因之一，高血壓性心臟病常伴隨一系列并發(fā)癥，包含左室肥厚、左房擴大、冠狀動脈疾病、充血性心力衰竭等[2]。臨床上很多治療高血壓的藥物同樣對心肌肥厚有很好的治療作用[3]。研究表明，許多調(diào)控高血壓的基因也參與調(diào)控心肌肥厚發(fā)生[4]。卵泡抑素樣蛋白4(follistatin-like 4，F(xiàn)STL4)是TGF-β超家族抑制劑follistatin基因家族的一員，廣泛表達于心臟、肺、腎、睪丸、神經(jīng)元、平滑肌和腸上皮中[5-6]。此前的一項研究，通過對高血壓患者及其家族的基因圖譜進行單核苷酸多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)FSTL4的突變可能是影響高血壓的一個關(guān)鍵誘因[6]。此外，研究發(fā)現(xiàn)FSTL4是肌肉發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，與卒中風(fēng)險增加相關(guān)[6-7]。因此，筆者利用FSTL4基因敲除小鼠和FSTL4過表達的心肌細胞來深入探究FSTL4在心肌肥厚中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 動物實驗材料與方法

1.1.1實驗動物 野生型(WT組)小鼠8只，F(xiàn)STL4基因敲除(KO組)小鼠8只，體重24～26g、10周齡雄性小鼠。KO小鼠購買自RIKEN BioResource Research Center(RBRC04952)，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)模式動物研究所SPF級實驗動物屏障設(shè)施。

1.1.2病理性心肌肥厚模型的建立 WT和KO組小鼠均進行主動脈弓縮窄手術(shù)(TAC)[8-9]，構(gòu)建壓力超負荷誘導(dǎo)的左室心肌肥厚模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿第2～3肋間水平切開皮膚，依次分離肌肉及軟組織，暴露出胸乳突肌，然后用直尖頭鑷提起左側(cè)鎖骨，用解剖剪緊貼胸骨剪斷小鼠右側(cè)鎖骨，游離主動脈弓(無名動脈和左頸總動脈分叉處)，將7-0手術(shù)縫線穿過主動脈，將26G墊針及主動脈一起結(jié)扎，抽出針頭造成主動脈70%縮窄，然后依次縫合切口。之后將小鼠以俯臥位放入恒溫箱中至蘇醒后，將小鼠放入裝有高壓滅菌過的墊料、飼料和飲用水的飼養(yǎng)籠內(nèi)，于飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)觀察。

1.1.3超聲檢測 術(shù)后4周用異氟烷麻醉小鼠后，對左胸前區(qū)剃毛，小鼠取左側(cè)臥位或仰臥位，在剃毛區(qū)均勻涂抹超聲耦合劑。采用高頻超聲診斷儀，頻率設(shè)置為15 MHz，選取標準左室乳頭肌短軸切面進行超聲檢測，測量并計算左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、短軸縮短率(FS)及射血分數(shù)(EF)。

1.1.4組織病理學(xué)檢測 超聲檢測結(jié)束后，稱重后處死小鼠，迅速取出心臟和肺臟，分別稱重并記錄。剪開小鼠后肢脛骨處皮膚，測量并記錄脛骨長度。計算心重體重比(HW/BW)、肺重體重比(LW/BW)、心重與脛骨長度的比值(HW/TL)，評價心臟重量的增大程度。稱重之后將心臟放入10%的福爾馬林中固定24 h，再進行脫水、石蠟包埋、切片，天狼猩紅染色(PSR)和蘇木精-伊紅染色(H&E)。

1.1.5實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(qPCR) 用TriPure Isolation Reagent(11667165001，Roche)提取心臟左心室的RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(4897030001，Roche)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入熒光染料SYBR Green(04887352001，Roche)標記擴增產(chǎn)物進行qPCR實驗，檢測心肌肥厚基因心鈉肽(Anp)、腦鈉肽(Bnp)和心臟β-肌球蛋白重鏈(Myh7)，心肌纖維化基因I型膠原(Collagen Iα )、Ⅲ型膠原(Collagen Ⅲ)和結(jié)締組織生長因子(Ctgf)的表達。所用引物由擎科生物科技有限公司進行化學(xué)合成，序列信息如下表：

表1 qPCR引物序列信息

1.1.6蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測 用眼科剪迅速將心臟左室樣本剪碎后放入EP管中，在干冰上操作，稱重并記錄樣本重量。向每個EP 管中加入4顆鋼珠和RIPA裂解液(100 μl/10 mg)，放入研磨儀中研磨組織，設(shè)置研磨參數(shù)：頻率30 Hz，時間90 s。待研磨結(jié)束后取出鋼珠，使用超聲裂解儀裂解組織細胞，頻率5K Hz，時間120 s。裂解完成后離心獲得蛋白提取液，使用BCA 法(23225，Thermo Fisher Scientific)調(diào)平蛋白濃度，將蛋白樣品變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳后將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，對PVDF膜使用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜，室溫孵育二抗1 h，于Bio-Rad ChemiDocTMXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行顯影。實驗中使用的一抗包括：FSTL4(ab214925，ABCAM)、GAPDH(2118，CST)、Flag(M185-3L，MBL)。

1.2 細胞實驗材料與方法

1.2.1H9C2細胞免疫熒光染色 H9C2細胞購買自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，利用慢病毒感染H9C2細胞構(gòu)建FSTL4過表達的穩(wěn)定細胞系。對細胞系饑餓12 h處理后，用1 μmol/L血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)或?qū)φ找篜BS刺激48 h，刺激后使用4%多聚甲醛固定細胞，將細胞置于0.1%Triton X-100中透化5 min，室溫下用8%羊血清封閉1 h，加α-actinin(05-384，Merck Millipore，1∶100)室溫孵育2 h進行染色，PBS漂洗后滴加熒光二抗(IgG[H + L]二抗，A21202，Invitrogen，1∶200)室溫孵育1 h，PBS漂洗后加DAPI封片，于熒光顯微鏡下進行拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量細胞的表面積。

1.2.2雙熒光素酶報告基因檢測 對H9C2細胞同時表達對照Flag或FSTL4質(zhì)粒、NFAT-luc、對照Actin-luc，18 h后用2μmol/L AngⅡ或?qū)φ找篜BS刺激細胞12 h，刺激完成后裂解細胞。吸取20 μl細胞裂解液和100 μl熒光素酶測試試劑Ⅱ(LARII)混勻，立即檢測螢火蟲熒光素的熒光值，加入100 μl STOP& Glo Reagent試劑混勻，立即檢測海腎熒光素的熒光值，熒光素酶的表達量與轉(zhuǎn)錄因子FSTL4對活化T細胞核因子(NFAT)的轉(zhuǎn)錄活性作用強度成正比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果通過平均數(shù)±標準差來表示，采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組之間均數(shù)比較使用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠實驗結(jié)果

2.1.1兩組超聲指標及心肌肥厚程度的比較 Western blot結(jié)果顯示KO小鼠心臟組織中FSTL4基因完全敲除(圖1A)。TAC手術(shù)4周后，KO組小鼠的LVEDd和LVESd均顯著高于WT組；而EF和FS顯著低于WT組(表2)。TAC手術(shù)4周后KO組小鼠的HW/BW、LW/BW和HW/TL均顯著高于WT組(表3)。

A：兩組小鼠心臟組織中FSTL4表達水平；B：TAC手術(shù)4周后兩組小鼠心肌肥厚和心肌細胞肥大程度

圖1兩組小鼠FSTL4蛋白表達和心肌肥厚程度的比較

表2 兩組超聲指標的比較

注：與WT組比較，*P<0.05

表3 兩組HW/BW、LW/BW、HW/TL的比較

注：與WT組比較，*P<0.05

HE染色結(jié)果顯示KO組小鼠心臟體積明顯增大，心肌細胞面積顯著增加(圖1B，表4)。TAC手術(shù)4周后，qPCR結(jié)果顯示KO組小鼠的Anp、Bnp和Myh7水平都高于WT組(表5)。

表4 兩組心肌細胞面積的比較

注：與WT組比較，*P<0.05

表5 兩組心肌肥厚基因表達量的比較

注：因n=3,未進行統(tǒng)計學(xué)處理，但KO組3個數(shù)據(jù)均高于WT組

2.1.2兩組心肌纖維化程度的比較 PSR染色結(jié)果顯示，KO組小鼠心臟組織血管周纖維化和間質(zhì)纖維化程度加重(圖2)，統(tǒng)計學(xué)分析表明KO組小鼠心肌的膠原纖維含量顯著升高(表6)。qPCR結(jié)果顯示，KO組小鼠的心臟纖維化指標Collagen Iα、CollagenⅢ和Ctgf都升高，顯示出嚴重的纖維化(表7)。

TAC手術(shù)4周后兩組小鼠心肌纖維化程度

組別n膠原百分比(%)WT組52.03±0.78KO組55.19 ±2.50?

注：與WT組比較，*P<0.05

表7 兩組心肌纖維化基因表達量的比較

注：因n=3,未進行統(tǒng)計學(xué)處理，但KO組3個數(shù)據(jù)均高于WT組

2.2 H9C2細胞實驗結(jié)果

2.2.1FSTL4對心肌細胞肥大的影響 Western blot結(jié)果顯示FSTL4穩(wěn)定細胞系中FSTL4的蛋白表達水平增加情況(圖3A)。免疫熒光染色結(jié)果顯示AngⅡ刺激導(dǎo)致心肌細胞肥大，F(xiàn)STL4過表達能夠抑制AngⅡ刺激導(dǎo)致的心肌細胞肥大(圖3B、表8)。qPCR結(jié)果顯示過表達FSTL4能夠顯著降低心肌肥厚指標Anp和Myh7的表達(表9)。

2.2.2FSTL4對NFAT轉(zhuǎn)錄活性的影響 雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，AngⅡ刺激H9C2細胞后活化T細胞核因子(NFAT)的轉(zhuǎn)錄活性顯著上升，過表達FSTL4能夠顯著抑制AngⅡ刺激誘導(dǎo)的NFAT轉(zhuǎn)錄激活(表10)。

3 討論

本研究采用FSTL4-KO小鼠為研究對象，在主動脈弓縮窄手術(shù)4周后檢測心臟重量、通過病理分析

A：H9C2細胞中FSTL4的過表達效率；B：AngII刺激后對照和過表達FSTL4的H9C2心肌細胞肥大程度

圖3 FSTL4過表達對心肌細胞肥大的影響

注：與Flag PBS組比較，*P<0.05；與Flag AngII組比較，#P<0.05

表9 不同組別心肌肥厚基因表達量的比較

注：因n=3,未進行統(tǒng)計學(xué)處理，但Flag AngⅡ組3個數(shù)據(jù)均高于Flag PBS組，F(xiàn)lag-FSTL4 AngⅡ組數(shù)據(jù)均低于Flag AngⅡ組

表10 不同組別NFAT轉(zhuǎn)錄活性的比較

注：因n=4,未進行統(tǒng)計學(xué)處理，但Flag AngⅡ組3個數(shù)據(jù)均高于Flag PBS組，F(xiàn)lag-FSTL4 AngⅡ組數(shù)據(jù)均低于Flag AngⅡ組

和超聲檢測，結(jié)合實時熒光定量PCR檢測心肌肥厚和心臟纖維化標志基因變化，全面考察了FSTL4對壓力超負荷誘導(dǎo)的病理性心肌肥厚的功能和作用。結(jié)果顯示FSTL4敲除之后，心肌細胞增大，心肌肥厚程度加重，心功能惡化，心肌纖維化程度加重，表明FSTL4敲除進一步促進了病理性心肌肥厚和心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。此外，采用FSTL4過表達的H9C2細胞為研究對象，并使用AngⅡ刺激誘導(dǎo)心肌細胞肥大模型。結(jié)果顯示過表達FSTL4顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細胞體積增大和心肌肥厚相關(guān)指標的表達，提示過表達FSTL4可抑制心肌肥厚的發(fā)生。

據(jù)報道，心肌肥厚的發(fā)生受多種復(fù)雜細胞信號通路調(diào)控，包含絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B、蛋白激酶 C和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcineurin)/激活NFAT等信號通路[10-12]。這些復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，通過感知上游刺激，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、活性氧釋放、炎癥反應(yīng)等一系列分子事件，調(diào)控心肌細胞中大量蛋白質(zhì)合成和表型轉(zhuǎn)化[13]。FSTL4 預(yù)測為一個分泌蛋白，結(jié)構(gòu)分析表明其由一個類卵泡抑素結(jié)構(gòu)域、一個鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個類免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成。FSTL4可影響小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育[14]，此外，F(xiàn)STL4通過調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的成熟和外泌來調(diào)控小鼠軸突分支[15]。

本研究顯示FSTL4抑制NFAT轉(zhuǎn)錄活性，提示FSTL4很可能作為一個鈣離子結(jié)合蛋白，通過調(diào)控Ca2+-Calcineurin-NFAT信號通路，影響下游NFAT信號通路的激活。Ca2+增加可以激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶Calcineurin，與轉(zhuǎn)錄因子NFAT結(jié)合，通過去除NFAT N端保守的絲氨酸殘基對其進行去磷酸化，導(dǎo)致NFAT向細胞核易位，激活心肌肥厚前體基因的表達。據(jù)報道，轉(zhuǎn)錄因子NFAT在激活后，可直接調(diào)控心肌肥厚標志物BNP的表達[16]。本研究中小鼠敲除FSTL4后，BNP表達顯著性上升，提示FSTL4可能通過Calcineurin-NFAT信號調(diào)控心肌肥厚和心臟重構(gòu)發(fā)生。