王永健 王海軍 于洋 李瑞卿 張嘉偉

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，黑龍江 齊齊哈爾 161041)

腦缺血再灌注損傷能夠引起腦部更加嚴(yán)重的功能障礙，并且隨著不斷實(shí)施的溶栓治療，腦缺血再灌注損傷的危害愈發(fā)明顯。腦缺血再灌注后能夠引起一系列病理損傷，包括中心區(qū)腦神經(jīng)元壞死、神經(jīng)元凋亡及去極化、氧自由基的產(chǎn)生等〔1〕。氧自由基的產(chǎn)生是導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷的重要原因，而體內(nèi)一些酶的代謝產(chǎn)物能夠介導(dǎo)炎癥及氧化應(yīng)激損傷〔2〕。

12/15-脂氧合酶可氧化花生四烯酸和亞油酸分別生成12-羥基二十碳四烯酸(HETE)、15-HETE、13-羥基十八碳二烯醇(HODE)等產(chǎn)物〔3〕，而這些產(chǎn)物能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷可顯著誘導(dǎo)腦組織PPARγ表達(dá)和核移位增加〔5〕。同時(shí)，PPARγ激活可減小腦梗死體積，降低炎性介質(zhì)細(xì)胞間黏附分子-1、白介素-1β、環(huán)氧合酶-2 等的表達(dá)〔6〕，說明腦缺血引起的PPARγ表達(dá)和活性增加可能是機(jī)體對(duì)于損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)。然而，激活PPARγ的內(nèi)源性物質(zhì)并不明確。有研究證明，15-HETE 在人血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中也可激活PPARγ，同時(shí)增加PPARγ mRNA水平〔7〕。 然而在腦內(nèi)是否由于12/15-脂氧合酶的代謝產(chǎn)物如15-HETE激活了PPARγ，進(jìn)而降低腦缺血再灌注損傷并不明確。本文擬對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1試劑及器材 15-HETE 購于美國 Biomol 公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度定量試劑盒購自碧云天生物試劑有限公司；PPARγ抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；12/15-脂氧合酶抗體購自美國Cayman Chemical公司；二抗為相應(yīng)辣根過氧化物耦聯(lián)的抗體，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；其他試劑均為市售分析純。線栓購自北京西濃科技有限公司，Molecular Imager ChemiDoc XRS+System 曝光儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2模型制備 SPF級(jí)SD雄性大鼠90只，體重200～220 g，購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院。線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻缺血60 min再灌注24 h模型(MCAO/R)。主要步驟：大鼠術(shù)前12 h 禁食，但不禁水，4%水合氯醛麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，取頸部正中切口2 cm，銳性分離頸前正中肌群，分離辨認(rèn)左側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后結(jié)扎離斷頸外動(dòng)脈，將0.22 mm硅膠線栓緩慢插入約10 mm，同時(shí)開始記錄缺血時(shí)間。 阻斷60 min后緩慢拔出線栓恢復(fù)血流再灌注，縫合手術(shù)切口。大鼠蘇醒后自由飲水和進(jìn)食。以缺血對(duì)側(cè)肢體癱瘓為模型成功的標(biāo)志。大鼠隨機(jī)分為3組(n=30)。假手術(shù)組僅手術(shù)暴露、分離頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，不插入線栓；模型組制備MCAO/R模型，在缺血前30 min右側(cè)腦室注入與干預(yù)組相同體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)；干預(yù)組制備MCAO/R模型，缺血前30 min右側(cè)腦室注入15 μl的15-HETE。 所有動(dòng)物于模型制備成功24 h后處死。

1.3總蛋白提取 取缺血側(cè)腦皮質(zhì)進(jìn)行蛋白提取和分離。處死后的大鼠取全腦，分離腦皮質(zhì)，置于-80℃冰箱保存。 將不同組的腦皮質(zhì)50 mg置于500 μl的放射免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(RIPA)細(xì)胞裂解液中，低溫勻漿，12 000 r/min離心，取上清液，用BCA蛋白濃度定量試劑盒進(jìn)行定量分析。蛋白變性后，于-20℃冰箱中保存。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，4℃孵育一抗(1∶1 000)、過夜，吐溫20-Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，每次10 min，常溫孵育二抗1 h，TBST洗3次，每次10 min，顯色試劑盒進(jìn)行顯色，Imagelab軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4Real Time-PCR 取缺血側(cè)腦皮質(zhì)進(jìn)行 mRNA提取和分離。定量稱取100 mg腦皮質(zhì)置于1 ml TRIzol中勻漿提取總RNA。通過測定260、280 nm吸光度測定RNA濃度。取500 ng總RNA 通過PrimeScript RT reagent 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過SYBR Premix EX Taq試劑盒進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。12/15-脂 氧合酶上 游 引 物 序 列 5′-TGGGTTCAGGGCAGAAGCAT-3′，下游引物序列5′-GCGGGCAGGAAGACAAGTAGAG-3′ 。PPARγ上游引物序列5′-GTGCCAGTTTCGATCCGTAGA-3′，下游引物序列5′-GGCCGACATCGTGTAGTAGA-3′。內(nèi)參 GAPDH 上游引物序列 5′-AGAACATCATCCCTGCATC-3′，下 游 引 物 序列 5′-TGGATACATTGGGGGTAGG-3′。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用 2-ΔΔCt方法。

1.515-HETE含量檢測 使用Assay Design公司的15-HETE酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒對(duì)腦組織中15-HETE的含量進(jìn)行測定，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0 軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1腦缺血再灌注損傷后12/15-脂氧合酶表達(dá)水平變化 模型組12/15-脂氧合酶基因表達(dá)水平(1.27±0.07)明顯高于假手術(shù)組(1.01±0.13)，24 h基因水平升高了27%。與基因水平結(jié)果類似，與空白組蛋白水平(1.01±0.04)相比，模型組12/15-脂氧合酶蛋白表達(dá)(1.32±0.21)明顯升高，24 h蛋白水平提高了30%。見圖1。

2.2腦缺血再灌注損傷后15-HETE含量變化 與假手術(shù)組(2.69±0.32)相比，模型組15-HETE在腦內(nèi)的水平(3.85±0.28)提高了43%，說明蛋白表達(dá)的變化引起了酶功能的改變。

圖1 假手術(shù)組和模型組腦內(nèi)12/15-脂氧合酶表達(dá)

2.3腦內(nèi)PPARγ含量的變化 與假手術(shù)組(1.05±0.03)相比，模型組腦內(nèi)PPARγ基因表達(dá)(1.26±0.09)明顯增加，增加了20%。與基因水平結(jié)果類似，與空白組PPARγ蛋白水平(1.17±0.13)相比，模型組PPARγ蛋白水平(1.58±0.16)增加了35%，說明腦缺血再灌注損傷能夠造成PPARγ在基因和蛋白水平的激活。見圖2。

2.4腦內(nèi)注射15-HETE后PPARγ表達(dá)變化 腦內(nèi)注射15-HETE后，與模型組PPARγ基因水平(1.08±0.05)和蛋白水平(1.63±0.15)相比，干預(yù)組PPARγ在基因和蛋白水平表達(dá)明顯升高，PPARγ在基因水平(1.24±0.11)提高了15%，在蛋白水平(2.20±0.27)提高了30%。見圖3。

圖2 假手術(shù)組和模型組腦內(nèi)PPARγ表達(dá)

圖3 干預(yù)組和模型組腦內(nèi)PPARγ表達(dá)

3 討 論

缺血性腦病致死和致殘率均較高，是腦血管病中主要的一種類型，缺血區(qū)血流的再灌注可引起腦組織損傷及相關(guān)功能障礙即腦缺血再灌注損傷〔8〕。缺血再灌注損傷能夠引起腦內(nèi)氧化應(yīng)激的改變進(jìn)而引起神經(jīng)元凋亡〔9〕。腦內(nèi)氧化應(yīng)激基因水平的改變是機(jī)體的一種保護(hù)機(jī)制，也為臨床治療提供了新的靶點(diǎn)?；ㄉ南┧岷蛠営退岽x通路是典型的氧化應(yīng)激反應(yīng)通路〔10〕。12/15-脂氧合酶能夠催化花生四烯酸和亞油酸產(chǎn)生15-HETE等生物活性物質(zhì)，參與腦損傷的病理過程。同時(shí)，PPARγ與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)，而且，PPARγ激活能降低腦損傷程度，如減少腦損傷面積。PPARγ激活劑羅格列酮可減輕繼發(fā)性腦損傷，并且對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用〔11〕。

本研究結(jié)果說明12/15-脂氧合酶參與了缺血再灌注損傷的過程。吳國建等〔2〕也發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦損傷后12/15-脂氧合酶的表達(dá)明顯升高。本研究結(jié)果表明，造模后腦內(nèi)15-HETE的含量明顯增加，說明12/15-脂氧合酶在蛋白水平的變化引起了其功能改變；而PPARγ能被進(jìn)一步激活，說明調(diào)節(jié)內(nèi)源性生物活性物質(zhì)能夠激活PPARγ，也為腦缺血再灌注損傷的治療提供了新的思路。