鄭心彤 古賢君 凌霄雁 梁釗 覃卿 杜秀日 林栩

【摘要】 目的 探討細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（erk）1/2通路抑制劑U0126對轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β1誘導(dǎo)足細(xì)胞炎癥因子分泌和微RNA（microRNA，miR）155表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞，隨機(jī)分為正常對照組、TGFβ1組和TGFβ1+U0126組，使用Western blot法檢測erk1/2磷酸化水平，ELISA法檢測足細(xì)胞上清TNFα及IL6蛋白表達(dá)水平，RTqPCR法檢測足細(xì)胞miR155表達(dá)水平。結(jié)果 與正常對照組相比，TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞后，erk1/2磷酸化水平明顯上升，足細(xì)胞上清IL6和TNFα蛋白分泌增多，足細(xì)胞miR155表達(dá)顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與TGFβ1組相比，TGFβ1+U0126組erk1/2磷酸化水平被抑制，足細(xì)胞上清IL6和TNFα蛋白分泌減少，足細(xì)胞miR155表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 erk1/2通路抑制劑U0126可抑制足細(xì)胞炎癥因子IL6、TNFα分泌，下調(diào)足細(xì)胞miR155的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 足細(xì)胞;U0126;IL6;TNFα;miR155

中圖分類號：R692 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.10031383.2019.05.002

【Abstract】 Objective To investigate the effects of U0126，an extracellular regulated protein kinases（erk）1/2 pathway inhibitor，on inflammatory cytokine secretion and （microRNA，miR）155 expression in podocytes induced by （transforming growth factor，TGF）β1.Methods Mouse podocytes were cultured in vitro and randomly divided into normal control group，TGFβ1 group and TGFβ1+U0126 group.The erk1/2 phosphorylation level was detected by Western blot，the expressions of supernatant TNFα and IL6 were detected by ELISA，and the miR155 expression in podocyte was detected by RTqPCR.Results Compared with the normal control group，the phosphorylation level of erk1/2 significantly increased，the secretion of supernatant IL6 and TNFα protein increased，and the expression of miR155 in podocytes significantly upregulated after TGFβ1 inducement，difference was statistically significant（P<0.05）.Compared with the TGFβ1 group，the phosphorylation level of erk1/2 in TGFβ1+U0126 group was inhibited，the secretions of IL6 and TNFα protein in podocyte supernatant decreased，and the miR155 expression in podocyte decreased，difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion erk1/2 pathway inhibitor U0126 can inhibit the secretions of inflammatory factors such as IL6 and TNFα，and downregulate miR155 expression in podocyte.

【Key words】 podocyte;U0126;IL6;TNFα;miR155

足細(xì)胞數(shù)量和功能的異?？蓪?dǎo)致大量蛋白尿，并發(fā)展為足細(xì)胞病。微小病變性腎病、膜性腎病和局灶節(jié)段性腎小球硬化癥等在內(nèi)的許多腎小球疾病均可出現(xiàn)足細(xì)胞損傷，如不及時給予有效的治療，最終可發(fā)展為慢性腎臟病[1]。目前足細(xì)胞病的治療主要為免疫干預(yù)及對癥支持治療。免疫干預(yù)治療多數(shù)藥物副作用較大，沒有針對性，療效不一。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，erk）1/2信號通路的主要功能是將細(xì)胞表面的信號受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核中，對細(xì)胞增殖及凋亡等過程具有調(diào)控作用。有研究表明，erk1/2通路的激活與單核細(xì)胞炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)，并介導(dǎo)調(diào)控了單核細(xì)胞黏附、吞噬和殺傷能力[2]。本課題組前期研究探索了轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β1通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[3]。本次實(shí)驗，我們繼續(xù)使用TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型，應(yīng)用erk1/2通路抑制劑U0126，研究U0126對TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞炎癥因子分泌和微RNA（microRNA，miR）155表達(dá)的影響，探討該通路作為腎小球疾病治療靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法1.1 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基（C11875500BT，Gibco）、優(yōu)級胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，SA21201，蘭州Cellmax）、PBS緩沖液（P1020500，北京Solarbio）、TGFβ1（96100212，美國PeproTech）、U0126（S1102，美國Selleck）、蛋白酶抑制劑混懸液（CW2200S，北京康為世紀(jì)）、磷酸酶抑制劑混懸液（CW2383S，北京康為世紀(jì)）、RIPA裂解液（P0010S，上海碧云天公司）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0010S，上海碧云天公司）、perk1/2（#4370，美國CST）、erk1/2抗體（#9102，美國CST）、GAPDH抗體（104941AP，美國Proteintech）、RNAiso Plus（9108，日本TaKaRa）、小鼠白介素（interleukin，IL）6 ELISA Kit（CSBE04639m，武漢華美公司）、小鼠腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）α ELISA Kit（CSBE04741m，武漢華美公司）、MirXTM miRNA FirstStrand Synthesis and SYBR qRTPCR（638315，美國Clontech Laboratories）、SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNaseH Plus，RR820A，日本TaKaRa）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 條件永生化小鼠足細(xì)胞購于復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞中心，培養(yǎng)條件參考本課題組前期研究，并適當(dāng)優(yōu)化[4]。培養(yǎng)使用1640培養(yǎng)基（含10% FBS），細(xì)胞在5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2天傳代一次。細(xì)胞復(fù)蘇后，傳代培養(yǎng)14天左右分化成熟后進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3 實(shí)驗種板及分組 實(shí)驗前一天將分化成熟的足細(xì)胞以5×104個/孔接種于6孔板中，每組設(shè)置3個平行孔，加入2 mL 含10% FBS的1640培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞貼壁生長至70%融合時，加入含1% FBS的1640培養(yǎng)基同步化24小時，之后根據(jù)實(shí)驗設(shè)計加入相應(yīng)處理試劑進(jìn)行實(shí)驗。細(xì)胞隨機(jī)設(shè)為：正常對照組、TGFβ1組和TGFβ1+U0126組。后兩組使用12 ng/mL TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞，其中，TGFβ1+U0126組給予20 nM U0126;正常對照組給予等體積含10% FBS的1640培養(yǎng)基。

1.4 Western blot法檢測erk1/2的磷酸化水平 倒去6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，使用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗3次，每孔加入100 μL 含1×蛋白酶抑制劑混懸液和1×磷酸酶抑制劑混懸液的RIPA裂解液，小心吹打混勻后冰浴裂解30分鐘，收集含細(xì)胞懸液至1.5 mL EP管中，4℃ 10 000 rpm離心10分鐘，收集含總蛋白的上清液。按BCA蛋白定量說明書操作測定總蛋白濃度，并使用RIPA裂解液調(diào)整蛋白濃度，將提取的總蛋白與5×SDS上樣緩沖液按比例配制，使其稀釋為1×SDS上樣緩沖液，在沸騰的水浴鍋中煮5分鐘使蛋白變性。每孔加入40 μg總蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，PVDF膜經(jīng)封閉液室溫封閉1小時后，分別用兔抗鼠perk1/2（1∶2000）、兔抗鼠erk1/2抗體（1∶1000）、兔抗鼠GAPDH抗體（1∶2000）4℃搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜10分鐘，重復(fù)3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育1小時，TBST洗膜10分鐘，重復(fù)3次。按ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒說明，使用凝膠成像系統(tǒng)顯影，目的條帶以Image J軟件測定灰度值。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzymelinked Immunosorbent Assay，ELISA）法檢測足細(xì)胞上清TNFα及IL6蛋白表達(dá) 收集6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，3500 rpm離心15 分鐘后取上清分裝，稀釋兩倍后進(jìn)行后續(xù)檢測。待ELISA試劑盒升至室溫后，取出96孔加樣板，每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品100 μL，小心混勻后室溫?fù)u床上反應(yīng)2小時。吸去孔內(nèi)液體后，每孔加入100 μL 1×生物素化抗體，室溫?fù)u床上反應(yīng)1小時，吸去孔內(nèi)液體并甩干，每孔加入200 μL 1×洗滌工作液靜置2分鐘，充分甩干，重復(fù)3次。吸去孔內(nèi)液體后，每孔加入100 μL 1×辣根過氧化物酶標(biāo)記結(jié)合物工作液，置于37℃溫箱中，搖床上反應(yīng)1小時，吸去孔內(nèi)液體并甩干，每孔加入200 μL 1×洗滌工作液靜置2分鐘，充分甩干，重復(fù)5次。每孔加入90 μL底物溶液室溫反應(yīng)30分鐘后，加入50 μL種終止液，5分鐘內(nèi)測定OD450及OD590。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR（Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）法檢測足細(xì)胞miR155的表達(dá) 按TaKaRa RNAiso Plus 總RNA提取試劑盒說明提取RNA，電泳檢測總RNA的完整性，紫外分光光度計檢測總RNA濃度。取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒配制反應(yīng)體系。U6引物由Clontech逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供，miR155引物由吉瑪公司合成并驗證。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)總體系為20 μL，每個樣本重復(fù)3次，以U6作為管家基因，采用2△△CT法計算miR155的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，經(jīng)正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗，計量資料均符合正態(tài)分布、方差齊，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)：α=005，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié) ?果2.1 U0126對TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞磷酸化erk1/2水平的影響 Western blot法檢測結(jié)果表明，TGFβ1可誘導(dǎo)足細(xì)胞erk1/2磷酸化水平明顯增高，磷酸化erk1/2與erk1/2灰度值之比為（1.09±0.10），U0126處理足細(xì)胞后，erk1/2磷酸化水平則被明顯抑制，灰度值之比為（0.51±0.04），但均高于正常對照組的灰度值之比（0.35±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。見圖1。

2.2 U0126對TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 ELISA法檢測足細(xì)胞上清IL6及TNFα蛋白的表達(dá)。TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中IL6蛋白表達(dá)水平為（56.67±1.51）ng/mL，與正常對照組（14.59±0.76）ng/mL相比明顯增加;而使用U0126抑制劑后，TGFβ1誘導(dǎo)增加的IL6蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下降，為（31.43±1.71）ng/mL，但仍高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞上清中TNFα蛋白表達(dá)水平也檢測到與IL6蛋白相同的變化趨勢，正常對照組為（23.29±1.28）ng/mL，表達(dá)較低，TGFβ1組為（83.62±2.67）ng/mL，較正常對照組明顯升高，TGFβ1+U0126組TNFα蛋白表達(dá)水平下降，為（68.16±1.40）ng/mL，但高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

2.3 U0126對TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞miR155表達(dá)水平的影響 RTqPCR法檢測足細(xì)胞miR155表達(dá)水平的變化。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞使miR155的表達(dá)水平升高（2.27±020）倍;U0126處理足細(xì)胞后，下調(diào)了miR155的表達(dá)，但仍為正常對照組的（1.94±0.06）倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

3 討 ?論 ?足細(xì)胞是位于腎小囊壁內(nèi)的臟層上皮細(xì)胞，環(huán)繞著腎小球毛細(xì)血管，足細(xì)胞向外伸展的足突相互交錯，形成了具有濾過功能的裂孔隔膜，是腎小球濾過屏障的重要組成部分。Guo等人[5]通過建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型證實(shí)，特異性減輕足細(xì)胞損傷，不僅能減緩腎小球硬化、減輕腎小管間質(zhì)纖維化，還能改善總生存率。這提示我們，足細(xì)胞損傷不僅參與了許多腎小球疾病的發(fā)病過程，還影響著疾病的發(fā)展和預(yù)后，針對足細(xì)胞特異性藥物的研究具有重要的臨床應(yīng)用價值。TGFβ1是屬于轉(zhuǎn)化生長因子家族β超家族的多功能細(xì)胞因子，廣泛參與了細(xì)胞增殖、生長、分化、凋亡等過程。有報道表明，TGFβ1可能通過增加雷帕霉素靶蛋白1表達(dá)及下游因子的磷酸化，參與誘導(dǎo)了足細(xì)胞凋亡的過程，但其具體作用機(jī)制仍不明確[6]。本課題組前期研究已證實(shí)，12 ng/mL TGFβ1能抑制足細(xì)胞增殖，下調(diào)足細(xì)胞特異性蛋白nephrin的表達(dá)，從而有效誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷[7]。本次研究，我們使用TGFβ1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞，并應(yīng)用erk1/2通路抑制劑U0126進(jìn)行干預(yù)，觀察U0126的應(yīng)用對炎癥因子釋放和miR155表達(dá)的影響，探討足細(xì)胞免疫炎癥性損傷的分子機(jī)制。

在細(xì)胞損傷應(yīng)激的過程中，常常由多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)，影響著細(xì)胞損傷的過程，erk1/2為信號通路的關(guān)鍵因子，也是許多藥物治療的重要靶點(diǎn)。在許多腎小球疾病中，均可出現(xiàn)erk1/2磷酸化水平的升高。Mouawad等人[8]研究發(fā)現(xiàn)，膜性腎病小鼠模型中，erk1/2通路被激活，并且與足細(xì)胞肌動蛋白骨架結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。Zhu等人[9]則抑制erk1/2通路的活性，觀察到系膜細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)也出現(xiàn)改變，影響了系膜增生性腎炎的進(jìn)展。此外，erk1/2磷酸化的水平與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，在急進(jìn)性腎小球腎炎中，erk1/2的活化不僅影響系膜細(xì)胞增生，還參與調(diào)控巨噬細(xì)胞浸潤[10]。本次研究結(jié)果表明，TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞后，erk1/2磷酸化的水平顯著升高，erk1/2通路被激活，這證實(shí)erk1/2通路參與了TGFβ1誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，而其調(diào)控作用的機(jī)制，我們將進(jìn)一步設(shè)計實(shí)驗對其進(jìn)行研究。

免疫性腎小球疾病的發(fā)病過程中，常伴隨著炎癥因子的產(chǎn)生，并繼發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。局灶節(jié)段性腎小球硬化的患者體內(nèi)，活化T細(xì)胞核因子1介導(dǎo)了TNFα的分泌，誘發(fā)游離膽固醇依賴性足細(xì)胞凋亡，影響了疾病的進(jìn)展[11]。在糖尿病腎病中，炎性因子IL6、TNFα釋放增加可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[12]。還有研究表明，霉酚酸酯、他克莫司和類固醇聯(lián)合治療狼瘡性腎炎時，可強(qiáng)烈抑制IL6途徑，有助于穩(wěn)定足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，因而表現(xiàn)出比常規(guī)治療更好的療效[13]。因此，炎癥免疫反應(yīng)是腎小球疾病發(fā)病的主要因素之一，研究U0126對TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞炎癥因子的影響具有重要意義。我們的實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞可顯著增加炎癥因子IL6、TNFα的釋放，引起足細(xì)胞炎癥應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步應(yīng)用U0126抑制erk1/2通路后，炎癥因子釋放減少，提示erk1/2通路參與調(diào)節(jié)TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷過程中的炎癥反應(yīng)，U0126的使用可減輕這一應(yīng)激反應(yīng)。

MiR155為非編碼微小RNA，在病理生理過程中，miRNA通過與靶基因結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)著基因表達(dá)，參與了許多疾病的發(fā)病機(jī)制，并且有望成為新的診斷標(biāo)志物。Muller等人[14]對不同腎小球疾病患者的尿液和體外培養(yǎng)的足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、腎小管細(xì)胞中miRNA的表達(dá)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)miR155表達(dá)顯著上調(diào)，有望成為腎小球疾病相關(guān)的新型診斷指標(biāo)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。眾所周知，miR155與免疫調(diào)節(jié)功能密切相關(guān)，不僅對免疫細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，還能影響免疫炎癥相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)。因此我們推測，miR155可能參與了U0126抑制TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞炎癥反應(yīng)的過程。本次研究我們發(fā)現(xiàn)，正常足細(xì)胞miR155的表達(dá)水平較低，TGFβ1干預(yù)后miR155的表達(dá)水平明顯上調(diào)，進(jìn)一步實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用U0126可下調(diào)TGFβ1誘導(dǎo)升高的miR155表達(dá)。這說明，miR155與U0126影響TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制關(guān)系密切，值得我們對其進(jìn)行深入研究。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)erk1/2在TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的過程中被明顯激活，U0126的應(yīng)用抑制了erk1/2通路，使炎癥因子IL6、TNFα釋放減少，miR155表達(dá)水平降低，從而減輕了TGFβ1誘導(dǎo)足細(xì)胞引起的炎癥應(yīng)激反應(yīng)。本研究有望為腎小球疾病足細(xì)胞損傷的治療提供新策略。