蔣虎剛 馮明霞 劉凱 任春貞 紀(jì)召娟 趙信科 李應(yīng)東

摘要：目的 ?基于Rho/Rock通路觀察當(dāng)歸紅芪多糖對(duì)H9C2細(xì)胞放射性損傷的影響，探討其干預(yù)放射性心肌損傷作用機(jī)制。方法 ?將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（不干預(yù)）、模型組（2 Gy X線照射并予生理鹽水干預(yù)）、陽性對(duì)照組（2 Gy X線照射并予陽性藥干預(yù)）和中藥低、中、高劑量組（2 Gy X線照射并予當(dāng)歸紅芪多糖干預(yù)），ELISA檢測(cè)細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、Rhoa、Rock mRNA的表達(dá)，Western blot檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)型iNOS、eNOS、Rhoa、Rock蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 ?與空白組比較，模型組細(xì)胞SOD、GSH、eNOS蛋白及eNOS mRNA表達(dá)下調(diào)，MDA、iNOS、RhoA、Rock蛋白及iNOS、RhoA、Rock mRNA表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞發(fā)生凋亡;與模型組比較，藥物干預(yù)組細(xì)胞SOD、GSH、eNOS蛋白及eNOS mRNA表達(dá)上調(diào)，MDA、iNOS、RhoA、Rock蛋白及iNOS、RhoA、Rock mRNA表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞凋亡減少。結(jié)論 ?當(dāng)歸紅芪多糖可通過抑制氧化應(yīng)激、Rho/Rock通路活化、細(xì)胞凋亡等干預(yù)放射性心肌損傷。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸紅芪多糖;氧化應(yīng)激反應(yīng);Rho/Rock通路;細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）05-0054-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.012 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effects of polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix on H9C2 cells injured by radiation based on Rho/Rhck pathway; To discuss its mechanism ofinterfere with radiation-induced heart disease （RIHD）. Methods The cells were randomly divided into blank group （no intervention）， model group （2 Gy X-ray irradiation and physiological saline intervention）， positive control group （2 Gy X-ray irradiation and positive medicine intervention）， and TCM low-， medium- and high-dosage group （2 Gy X-ray irradiation and intervention with polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix）. The expressions of SOD， MDA and GSH were detected by ELISA. The QT-PCR method was used to detect the expressions of iNOS， eNOS， RhoA and Rock mRNA， and the expressions of iNOS， eNOS， RhoA and Rock protein were detected by Western blot. The apoptosis of each group was detected by flow cytometry. Results Compared with the blank group， the expressions of SOD， GSH， eNOS protein and eNOS mRNA were down-regulated in the model group， and the expressions of MDA， iNOS， Rhoa， Rock protein and iNOS， RhoA， Rock mRNA were up-regulated， and cells were under apoptosis. Compared with the model group， the expressions of SOD， GSH， eNOS protein and eNOS mRNA were up-regulated， and the expressions of MDA， iNOS， RhoA， Rock protein and iNOS， RhoA and Rock mRNA were down-regulated， and apoptosis was alleviated in medicine intervention groups. Conclusion Polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix can interfere with RIHD by inhibiting oxidative stress， activation of Rho/Rock pathway， and apoptosis.

Keywords： polysaccharide from Angelicae Sinensis Radix and Hedysari Radix; oxidative stress; Rho/Rock pathway; apoptosis

胸腔惡性腫瘤放射治療及心臟介入手術(shù)的廣泛開展，不可避免造成放射性心肌損傷（radiation- induced heart disease，RIHD）[1]。射線劑量的增加是提高放療效果的重要手段之一，RIHD限制放射劑量的提高使其療效減低，但RIHD亦是慢性心力衰竭的重要病因之一[2]。研究發(fā)現(xiàn)，RIHD表現(xiàn)為心臟的遲發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，其后期心臟組織最主要的病理改變是心肌纖維化[3-4]，而纖維化是一種不可逆的病理改變。目前對(duì)RIHD發(fā)病機(jī)制、干預(yù)措施尚無統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但有研究結(jié)果表明，RIHD可能與Rho/Rock信號(hào)通路關(guān)系密切，同時(shí)Rho/Rock信號(hào)通路與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡等亦存在著緊密聯(lián)系[5]。因此，基于Rho/Rock信號(hào)通路探討RIHD的發(fā)病機(jī)制、防治策略具有客觀基礎(chǔ)。研究表明，當(dāng)歸紅芪多糖成分有清除自由基、抗氧化、抗炎等作用[6-7]，但其防治RIHD的機(jī)制、療效尚未明確。因此，本研究以Rho/Rock信號(hào)通路為中心，采用ELISA、QT-PCR、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)等手段探討氧化應(yīng)激、Rho/Rock通路活化、細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，進(jìn)一步揭示RIHD發(fā)病機(jī)制及當(dāng)歸紅芪多糖的干預(yù)作用，為防治RIHD及早期預(yù)防心力衰竭提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?細(xì)胞

H9C2細(xì)胞由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所提供，經(jīng)劉凱副教授鑒定為正常H9C2細(xì)胞。

1.2 ?藥物與試劑

當(dāng)歸紅芪多糖為本課題組前期分離所得[6-7]，批號(hào)2016-06-3;硫辛酸，批號(hào)20161012013F，上海士鋒生物科技有限公司;法舒地爾，批號(hào)I10428-201601，南京萊富賽生物科技有限公司;兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體、兔抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體、兔抗RhoA抗體、兔抗Rock抗體，上?？道噬锟萍加邢薰?超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）試劑盒，南京建成生物化學(xué)試劑有限公司;總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;Annexin Ⅴ-FITC試劑盒，德國(guó)Miltenyi Biotec公司。

1.3 ?儀器

超凈工作臺(tái)、Eppendorf移液槍、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀，Thermo公司;實(shí)時(shí)定量PCR儀、核酸蛋白濃度測(cè)定儀，BIO-RAD公司;高速低溫離心機(jī)，Sigma公司;精密電子天平，OHAUS公司;流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson公司。

1.4 ?造模

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，2 Gy輻射劑量為建立RIHD細(xì)胞模型的最佳輻射劑量，同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)輻射劑量[8-9]，因此本研究采用2 Gy輻射劑量X線照射建立RIHD模型。

1.5 ?干預(yù)

將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組（不干預(yù)）、模型組（2 Gy X線照射并予生理鹽水干預(yù)）、陽性對(duì)照組（2 Gy X線照射并予0.2 mmol/L硫辛酸或0.1 mmol/L法舒地爾溶液干預(yù)）和中藥低、中、高劑量組（2 Gy X線照射并分別予當(dāng)歸紅芪多糖0.1、0.2、0.4 g/L干預(yù)）。上述給藥均為單次給藥，給藥體積均為0.2 mL，給藥時(shí)間均為模型建立完成后，檢測(cè)時(shí)間為給藥后24 h。

1.6 ?指標(biāo)檢測(cè)

SOD、MDA、GSH檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，主要步驟包括：加樣0.1 mL樣本后37 ℃孵育1 h，洗滌3次后滴加酶標(biāo)抗體0.1 mL，37 ℃孵育1 h，洗滌后加顯色液0.1 mL，37 ℃孵育30 min，最后終止反應(yīng)并檢測(cè)。PCR檢測(cè)時(shí)根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞中總mRNA，并根據(jù)表1要求配制反轉(zhuǎn)錄體系。反轉(zhuǎn)錄程序：25 ℃、5 min，42 ℃、60 min，70 ℃、10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增體系見表2。擴(kuò)增程序反應(yīng)設(shè)置：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)細(xì)胞mRNA的表達(dá)，引物序列見表3。Western blot檢測(cè)時(shí)依次提取制備蛋白樣品、配制凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、曝光，濃縮膠電泳（80 V），分離膠電泳（120 V），轉(zhuǎn)膜（80 V、120 min），采用Bio-RAD檢測(cè)條帶，并用Bio-RAD Quantityone圖像分析軟件檢測(cè);流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按Annexin Ⅴ-FITC試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPPS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?ELISA檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組細(xì)胞SOD、GSH表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），MDA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）;與模型組比較，陽性對(duì)照組細(xì)胞SOD、GSH表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01），MDA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）;中藥低劑量組SOD、GSH表達(dá)上調(diào)，MDA表達(dá)無改變;中藥中劑量組細(xì)胞SOD、GSH表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），MDA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）;中藥高劑量組細(xì)胞SOD、GSH表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05，P<0.01），MDA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01）。結(jié)果見表4。

2.2 ?RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），eNOS mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，陽性對(duì)照組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），eNOS mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）;中藥低劑量組細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），eNOS、RhoA mRNA表達(dá)無改變（P>0.05）;中藥中劑量組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01），eNOS mRNA表達(dá)無改變（P>0.05）;中藥高劑量組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01），eNOS mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。結(jié)果見表5。

2.3 ?Western blot檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05），eNOS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）;與模型組比較，陽性對(duì)照組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.01），eNOS蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）;中藥低劑量組細(xì)胞iNOS、Rock蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01），eNOS、RhoA蛋白表達(dá)無改變（P>0.05）;中藥中劑量組細(xì)胞RhoA、Rock、iNOS蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01），eNOS蛋白表達(dá)無改變（P>0.05）;中藥高劑量組細(xì)胞iNOS、RhoA、Rock蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01），eNOS蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。結(jié)果見表6、圖1。

2.4 ?流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組早、晚期凋亡細(xì)胞比例均明顯增高（P<0.05，P<0.01），正常細(xì)胞比例明顯降低（P<0.01）;與模型組比較，陽性對(duì)照組晚期凋亡細(xì)胞比例明顯降低（P<0.01），早期凋亡細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05），正常細(xì)胞比例明顯升高（P<0.01）;中藥低劑量組早、晚期凋亡細(xì)胞比例無明顯降低（P>0.05），正常細(xì)胞比例無明顯升高（P>0.05）;中藥中劑量組晚期凋亡細(xì)胞比例明顯降低（P<0.05），早期凋亡細(xì)胞比例無明顯降低（P>0.05），正常細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05）;中藥高劑量組早、晚期凋亡細(xì)胞比例均明顯降低（P<0.05，P<0.01），正常細(xì)胞比例明顯升高（P<0.01）。見表7、圖2。

3 ?討論

3.1 ?放射性心肌損傷氧化應(yīng)激反應(yīng)與Rho/Rock通路活化

本研究發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞SOD、GSH的表達(dá)顯著升高而MDA的表達(dá)明顯降低，同時(shí)Rho/Rock通路明顯活化，表明RIHD時(shí)細(xì)胞發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激與Rho/Rock通路活化，但關(guān)于RIHD時(shí)氧化應(yīng)激與Rho/Rock通路活化的關(guān)系尚不明確。因此本研究采用硫辛酸干預(yù)RIHD氧化應(yīng)激后比較Rho/Rock通路活化水平，發(fā)現(xiàn)抑制氧化應(yīng)激后Rho/Rock通路活化明顯受到抑制，表明氧化應(yīng)激是Rho/Rock通路活化的上游信號(hào)。本研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸紅芪多糖干預(yù)氧化應(yīng)激并抑制Rho/Rock通路活化時(shí)具有劑量依賴性，高劑量當(dāng)歸紅芪多糖對(duì)氧化應(yīng)激及Rho/Rock通路活化具有明顯的抑制作用。通過比較當(dāng)歸紅芪多糖各組SOD、MDA、GSH的水平發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸紅芪多糖對(duì)SOD、MDA較GSH具有更為明顯的調(diào)節(jié)作用。GSH是自身合成的一種非酶性抗氧化劑，可作為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、能量代謝等多種代謝活動(dòng)的供氫體;在參與抗氧化反應(yīng)時(shí)，其可通過自身巰基與氧自由基等結(jié)合及復(fù)活已被滅活的巰基酶而減少氧自由基對(duì)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白的破壞;細(xì)胞凋亡早期，在巰基轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)下GSH維持半胱氨酸的還原狀態(tài)而使其自身水平降低，可作為氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)[10-11]。因此，推測(cè)本研究中當(dāng)歸紅芪多糖對(duì)GSH表達(dá)調(diào)節(jié)作用較弱的可能機(jī)制為當(dāng)歸紅芪多糖能更為廣泛的抑制氧化應(yīng)激、減少氧自由基生成而減少GSH的消耗。

3.2 ?Rho/Rock通路活化與細(xì)胞凋亡

本研究發(fā)現(xiàn)模型組細(xì)胞早、晚期凋亡細(xì)胞比例明顯升高，且正常細(xì)胞比例明顯降低，表明細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡，而細(xì)胞凋亡與Rho/Rock通路活化的相關(guān)性尚不明確。因此，本研究通過法舒地爾抑制Rho/Rock通路活化后檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化，發(fā)現(xiàn)抑制Rho/Rock通路活化后細(xì)胞凋亡明顯減輕，表明細(xì)胞凋亡是Rho/Rock通路活化的下游信號(hào)。通過通過比較當(dāng)歸紅芪多糖各組細(xì)胞凋亡水平發(fā)現(xiàn)，低劑量當(dāng)歸紅芪多糖無調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡作用;中劑量當(dāng)歸紅芪多糖可調(diào)節(jié)細(xì)胞晚期凋亡及正常細(xì)胞水平，而無調(diào)節(jié)早期凋亡作用;高劑量當(dāng)歸紅芪多糖可調(diào)節(jié)細(xì)胞早、晚期凋亡及正常細(xì)胞水平，表明中、高劑量當(dāng)歸紅芪多糖可明顯調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。研究表明，Caspase-3是一種潛在的Rock激動(dòng)劑，可破壞Rock分子的自身折返并暴露其活化中心，而活化的Rock可激活Caspase-3，并使其自身裂解產(chǎn)生Rock，因此，Rock既是Caspase-3的激動(dòng)劑又是其活化產(chǎn)物[12-13]。推測(cè)當(dāng)歸紅芪多糖通過抑制Rho/Rock通路活化減少凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)Caspase-3表達(dá)的減低又可抑制Rho/Rock通路活化，從而形成良性循環(huán)，進(jìn)一步干預(yù)RIHD時(shí)Rho/Rock通路活化與細(xì)胞凋亡，并干預(yù)RIHD。

綜上所述，高劑量X線輻射可致細(xì)胞氧化應(yīng)激后激活Rho/Rock通路并進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而當(dāng)歸紅芪多糖可通過抑制氧化應(yīng)激、Rho/Rock通路活化、細(xì)胞凋亡3條途徑干預(yù)RIHD。本研究通過探討RIHD的發(fā)病機(jī)制及當(dāng)歸紅芪多糖干預(yù)RIHD的作用機(jī)制，為突破放療瓶頸、防治RIHD及早期預(yù)防心力衰竭提供依據(jù)。

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（收稿日期：2018-10-10）

（修回日期：2018-10-25;編輯：華強(qiáng)）