基于核酸外切酶Ⅲ輔助雙循環(huán)等溫信號放大的高靈敏Hg²⁺傳感方法研究

張何 王青 楊梅 傅昕

摘?要?設(shè)計了一種Hg2+觸發(fā)的核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）輔助的雙發(fā)夾探針雙循環(huán)等溫信號放大策略，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了一種免標記、超靈敏的Hg2+生物傳感器。在Hg2+存在情況下，發(fā)夾探針1的3'游離序列與汞離子識別探針通過T-?Hg2+-T配位結(jié)合形成雙鏈DNA平末端，核酸外切酶Exo Ⅲ能識別雙鏈DNA平末端并沿3'-5'方向催化水解莖部序列。釋放的Hg2+和識別探針進入新一輪反應(yīng)循環(huán)（循環(huán)1）;釋放的發(fā)夾探針1未降解序列包含Ⅰ區(qū)序列和G-四鏈體形成序列，其中，Ⅰ區(qū)序列與發(fā)夾探針2的3'游離序列（Ⅰ區(qū)序列）完全互補，引發(fā)了Exo Ⅲ參與的雙鏈DNA平末端水解，釋放的Ⅰ區(qū)序列進入新一輪反應(yīng)循環(huán)（循環(huán)2）。循環(huán)1和2為自發(fā)循環(huán)過程，經(jīng)過多次循環(huán)可以產(chǎn)生大量單鏈的G-四鏈體序列。體系中加入氯化血紅素，與G-四鏈體結(jié)合形成G-四鏈體-血紅素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反應(yīng)體系顯色?？疾炝硕喾N因素對檢測體系的影響，在最優(yōu)實驗條件下，此方法對Hg2+的線性檢測范圍為0.3～50 pmol/L，檢出限為0.25 pmol/L（S/N=3），回歸方程為ΔA420 nm=0.117+0.004CHg2+ （pmol/L）。當水樣中存在大量其它金屬離子時，傳感器對Hg2+仍然具有較高的選擇性。將此方法應(yīng)用于環(huán)境水體中Hg2+含量檢測，加標回收率為96.0%～106.0%。本方法操作簡單、選擇性好、靈敏度高、有較強的抗干擾性能，可用于環(huán)境水樣中Hg2+的高靈敏檢測。

關(guān)鍵詞?等溫信號放大; 核酸外切酶Ⅲ; G-四鏈體-血紅素DNA酶; 汞離子; 比色分析

1?引 言

汞具有非生物降解性和生物蓄積性等特性，即使在低濃度情況下，也能對人體健康造成毒害影響[1，2]，因此，汞污染一直是嚴重的環(huán)境問題。水溶性的二價汞離子（Hg2+）是汞最常見和最穩(wěn)定的存在形式之一[3，4]，近年來，Hg2+污染日益嚴重，因此發(fā)展靈敏度高、選擇性好、成本低、通用性強、操作簡便的痕量Hg2+定量分析技術(shù)已經(jīng)成為環(huán)境監(jiān)測的中心任務(wù)之一。

目前，用于Hg2+檢測的傳統(tǒng)方法主要包括電感耦合等離子體質(zhì)譜法[5]、原子吸收發(fā)射光譜法[6]、冷蒸氣原子熒光光譜法[7]、電化學法等[8]，這些方法具有較好的特異性、準確性及靈敏度，但依賴精密儀器、操作過程復(fù)雜、成本較高等缺點，限制了其在現(xiàn)場檢測的應(yīng)用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，胸腺嘧啶（T）與Hg2+之間能夠通過NHg鍵形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，并且T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)中的NHg鍵比Watson-Crick氫鍵更穩(wěn)定[9]，由此可以實現(xiàn)Hg2+的高選擇性識別。基于該結(jié)構(gòu)，發(fā)展了許多Hg2+檢測新技術(shù)，如熒光光度法[10]、電化學方法[11]、表面等離子體共振[12]、表面增強拉曼散射[13]和比色傳感器[14，15]等，但這些方法的靈敏度普遍較低。為了解決Hg2+檢測的靈敏度問題，缺刻核酸內(nèi)切酶被用于輔助Hg2+循環(huán)利用信號放大。Hg2+的存在可以引發(fā)缺刻核酸內(nèi)切酶對含有T-T錯配的DNA二聚體的切割活性，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)被核酸酶消化后，Hg2+從T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)中釋放出來，并引發(fā)新一輪切割。因此，樣品中包含的痕量Hg2+通過循環(huán)利用可以產(chǎn)生較高的響應(yīng)信號[16，17]。但是，由于缺刻核酸內(nèi)切酶的激活需要識別特定序列，導(dǎo)致Hg2+識別DNA探針的設(shè)計比較嚴苛，限制了該類技術(shù)的應(yīng)用范圍。

近年來，由于具有酶激活不依賴特定序列的識別及能夠被T-Hg2+-T特異識別形成的3'平末端高效激活等優(yōu)點，核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）被廣泛應(yīng)用于開發(fā)選擇性好、靈敏度高的靶標循環(huán)利用信號放大新技術(shù)[18，19]。然而，近期發(fā)展的Exo Ⅲ輔助的Hg2+循環(huán)利用檢測策略主要為Hg2+單循環(huán)利用技術(shù)。Ren等[20]設(shè)計了一種通過Hg2+引發(fā)末端結(jié)合并形成3'平末端的發(fā)夾DNA探針，在Exo Ⅲ輔助下，通過Hg2+循環(huán)利用放大信號，對水樣中Hg2+檢出限為10 pmol/L; Chen等發(fā)展了一種便攜式試紙條生物傳感器用于Hg2+的可視化檢測，該方法通過T-Hg2+-T的特異性識別誘導(dǎo)雙鏈核酸探針形成3'平末端，進而引發(fā)Exo Ⅲ輔助的Hg2+單循環(huán)利用信號放大，Hg2+檢出限為1 pmol/L[21]。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計并構(gòu)建Exo Ⅲ輔助的靶目標多重循環(huán)利用策略，可進一步提高Hg2+檢測的靈敏度。

作為一種重要的酶促信號放大方法，DNA酶催化技術(shù)由于具有成本低、操作簡單、檢測快速等優(yōu)點，在生物分析和生物傳感領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[22]。具有類過氧化物酶活性的G-四鏈體-血紅素DNA酶是近年來該領(lǐng)域研究的熱點之一，已被廣泛用于高靈敏傳感器的構(gòu)建，并用于病毒[23]、金屬離子[24]、小分子[25]等的檢測。

本研究利用Exo Ⅲ輔助的靶目標循環(huán)利用信號放大、Hg2+觸發(fā)的核酸探針末端結(jié)合以及G-四鏈體-血紅素DNA酶的催化信號放大的技術(shù)優(yōu)勢，設(shè)計并構(gòu)建一種免標記、超靈敏的雙發(fā)夾探針介導(dǎo)的雙循環(huán)信號放大體系， 用于Hg2+比色傳感。此體系整合3種信號放大技術(shù)：Exo Ⅲ輔助的Hg2+循環(huán)利用（循環(huán)1）、Exo Ⅲ輔助的Ⅰ區(qū)序列循環(huán)利用（循環(huán)2）以及基于DNA酶的催化信號放大。本方法具有簡單方便、成本低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點，可用于現(xiàn)場檢測自來水、湖水、河水等水體中的Hg2+含量。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）; 7700X型電感耦合等離子體質(zhì)譜（安捷倫公司）; THZ-C-1 臺式冷凍恒溫搖床（太倉市實驗設(shè)備廠）; ?Milli-Q Reference 超純水器（德國默克密理博公司）; 高速離心機（艾本德生命科學公司）; pH-2602 酸度計（杭州陸恒生物科技有限公司）; 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）; DH300恒溫金屬?。ê贾萑鹫\儀器有限公司）。

氯化血紅素（Hemin）、2，2'-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲亞砜（DMSO）、HgCl2、Pb（NO）2、CdCl2、FeCl3及其它金屬離子溶液均購自上海生工生物工程股份有限公司。所用試劑均為分析純，且未經(jīng)過進一步純化。實驗用水為超純?nèi)ルx子水。

DNA探針由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列信息見表1。

2.2?實驗方法

2.2.1?發(fā)夾探針的制備?發(fā)夾探針1、發(fā)夾探針2及汞離子識別探針用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4，包含70 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，20 mmol/L KCl）配制。為了減少非發(fā)夾二聚體的產(chǎn)生，并提高發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成比例，采用逐步緩慢退火方法。將發(fā)夾探針1（0.5 μmol/L）和發(fā)夾探針2（0.5 μmol/L）于冰上溶解，隨后90℃孵育10 min，70℃孵育10 min，50℃孵育30 min，30℃孵育10 min，最后于室溫放置30 min。

2.2.2?Hg2+比色分析?移取25 μL發(fā)夾探針1（0.5 μmol/L）、25 μL發(fā)夾探針2（0.5 μmol/L）和25 μL 汞離子識別探針（0.2 μmol/L）于滅菌離心管中，加入0.5 μL Exo Ⅲ （20 U/μL）和25 μL不同濃度的Hg2+溶液，25℃孵育60 min ，再加熱到80℃，保溫10 min，滅活Exo Ⅲ。加入0.5 μL 0.4 μmol/L Hemin，避光下37℃孵育60 min。移取10 μL上述溶液，加入45 μL ABTS（4 mmol/L）和45 μL H2O2 （4 mmol/L），37℃反應(yīng)8 min。選擇420 nm處的吸光度作為測量值，定義ΔA420 nm=A420 nm-A0，其中，A420 nm為樣品測量值，A0為Hg2+濃度為0時的背景值。

3?結(jié)果與討論

3.1?檢測原理

本研究設(shè)計了2個具有特定序列的發(fā)夾探針，借助T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)形成的特異性、Exo Ⅲ輔助的靶目標循環(huán)利用以及G-四鏈體-血紅素DNA酶的催化信號放大性能，構(gòu)建了一種基于Hg2+引發(fā)和Exo Ⅲ輔助的靶目標雙循環(huán)回收利用信號放大技術(shù)，用于Hg2+比色傳感。G-四鏈體的形成至少需要4組連續(xù)或相互靠近的GGG序列，發(fā)夾探針1和發(fā)夾探針2的序列都含有4組GGG重復(fù)序列，但由于2個探針在形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)時都有2組GGG被包含在莖部區(qū)域，因此不能形成分子內(nèi)G-四鏈體。如圖1所示，在發(fā)夾探針1、發(fā)夾探針2、汞離子識別探針及Hg2+存在時，汞離子識別探針的5'端序列與發(fā)夾探針1的3'末端單鏈游離序列（富含T堿基）通過形成2個T-Hg2+-T特異性配位結(jié)構(gòu)相互雜交，并在發(fā)夾探針1的3'末端形成了雙鏈DNA平齊末端，此時，汞離子識別探針的3'端設(shè)計為游離末端，不能被Exo Ⅲ切割。 在這種情況下，Exo Ⅲ能識別雙鏈DNA平末端并沿3'-?5'方向催化水解發(fā)夾探針1的莖部序列，釋放出單核苷酸、Hg2+、汞離子識別探針及發(fā)夾探針1未降解序列。釋放的Hg2+和汞離子識別探針可引發(fā)新一輪發(fā)夾探針1的Exo Ⅲ切割反應(yīng)，由此形成反應(yīng)循環(huán)（循環(huán)1）; 釋放的發(fā)夾探針1未降解序列中包含的5'莖部序列（Ⅰ區(qū)序列），可與發(fā)夾探針2的3'末端單鏈游離序列（Ⅰ區(qū)序列）完全互補，形成雙鏈DNA平齊末端，引發(fā)Exo Ⅲ參與的雙鏈DNA平末端切割，水解發(fā)夾探針2的莖部序列，釋放出Ⅰ區(qū)序列進入新一輪反應(yīng)循環(huán)（循環(huán)2）。循環(huán)1和2為自發(fā)循環(huán)過程，經(jīng)過多次循環(huán)可以產(chǎn)生大量單鏈的G-四鏈體序列。在體系中加入氯化血紅素，與G-四鏈體結(jié)合形成G-四鏈體-血紅素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反應(yīng)體系顯色。由于G-四鏈體-血紅素-DNA酶的量與吸光度呈正相關(guān)，設(shè)計的Exo Ⅲ輔助雙循環(huán)靶標回收利用策略能夠顯著放大檢測信號。

3.2?實驗條件的優(yōu)化

考察了影響雙發(fā)夾探針雙循環(huán)等溫信號放大系統(tǒng)分析性能的實驗條件對檢測的影響，包括T-T錯配數(shù)目、Exo Ⅲ催化反應(yīng)溫度及時間、Exo Ⅲ濃度。

3.2.1?T-T錯配數(shù)目的選擇?發(fā)夾探針1的3'端游離序列與汞離子識別探針之間可通過T-Hg2+-T錯配互補結(jié)合，其T-T錯配數(shù)目對Hg2+檢測系統(tǒng)的性能非常重要。設(shè)計了4種汞離子識別探針，分別能夠形成1～4個T-T錯配。結(jié)果如圖2A所示，在Hg2+存在情況下，末端存在2個T-T錯配的識別體系表現(xiàn)出較高的吸光值。因此，后續(xù)選擇汞離子識別探針2，在Hg2+存在時，此探針能夠高效誘導(dǎo)雙鏈平末端形成，并激活Exo Ⅲ輔助的雙循環(huán)目標再利用信號放大，用于Hg2+含量分析。

3.2.2?Exo Ⅲ催化反應(yīng)溫度的選擇?考察了不同的Exo Ⅲ反應(yīng)溫度（10～35 ℃）對Hg2+比色傳感體系信號的影響。如圖2B所示，在10～25℃范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度升高，反應(yīng)體系ΔA420 nm增加; 但在25～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，吸光值反而降低。這是由于反應(yīng)溫度較高時，汞離子識別探針較短，不能穩(wěn)定地與發(fā)夾探針1的3'游離序列雜交，Exo Ⅲ與之結(jié)合不穩(wěn)定，導(dǎo)致催化活性降低; 另外，反應(yīng)溫度較高時，發(fā)夾探針1和2的莖部序列結(jié)合不穩(wěn)定，直接打開后可形成分子內(nèi)G-四鏈體，背景信號升高 （在沒有Hg2+的情況下）。為了獲得最佳檢測信號（ΔA420 nm），后續(xù)實驗的反應(yīng)溫度采用25℃。

3.2.3?Exo Ⅲ催化反應(yīng)時間的選擇?Exo Ⅲ的催化反應(yīng)時間對信號放大有較大影響。如圖2C所示，隨著反應(yīng)時間延長，ΔA420 nm不斷增加，孵育60 min后，信號達到穩(wěn)定，隨后開始下降，這主要是背景信號逐漸升高導(dǎo)致的。因此，催化反應(yīng)時間選擇60 min。

3.2.4?Exo Ⅲ濃度的選擇?Exo Ⅲ的工作濃度對于信號放大系統(tǒng)非常關(guān)鍵。體系響應(yīng)信號隨Exo Ⅲ濃度的增加而增大，在10 U Exo Ⅲ時達到最大值; 隨著Exo Ⅲ濃度進一步升高，響應(yīng)信號反而下降。這是由于反應(yīng)體系中無論Hg2+是否存在，高濃度的Exo Ⅲ會不可控地切割DNA探針，從而導(dǎo)致背景信號升高。因此，Exo Ⅲ的最佳工作濃度為10 U。

綜上，選擇Hg2+引發(fā)的末端結(jié)合位點存在2個T-T錯配位點、Exo Ⅲ催化溫度25℃、Exo Ⅲ孵育時間60 min和10 U 的Exo Ⅲ工作濃度為最佳實驗條件。

3.3?Hg2+的選擇性分析

考察了不同離子（Zn2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Co2+）對檢測體系響應(yīng)信號的影響。結(jié)果如圖3所示，在最優(yōu)實驗條件下，空白對照（未加入任何干擾離子）的吸光值與分別加入單一不同種類干擾離子的反應(yīng)體系吸光值相近（黑色柱狀圖），說明以上離子對此傳感體系無顯著影響; 考察了Hg2+與其它金屬離子共存時的信號值變化情況，向反應(yīng)體系中同時加入100 pmol/L的Hg2+和上述10 nmol/L干擾離子，結(jié)果顯示，各共存反應(yīng)體系的吸光值與空白對照吸光值相差不大（白色柱狀圖），相對誤差在1.5%～3.1%之間，證明以上幾種金屬離子對Hg2+檢測的干擾很小，設(shè)計的生物傳感器對Hg2+具有高的選擇性。

3.4?Hg2+的定量檢測

在最優(yōu)實驗條件下，采用本方法測定了不同濃度的Hg2+標準液的響應(yīng)信號。由圖4A可知，隨著Hg2+濃度的增大，反應(yīng)體系在420 nm的吸光值不斷升高，。Hg2+濃度在0.3～50 pmol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖4B），回歸方程為ΔA420 nm=0.117+0.004CHg2+（R2=0.992）， 檢出限為0.25 pmol/L（3σ），遠低于我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定的飲用水中無機Hg2+的最高允許水平（<5 nmol/L，1 ppb）。

結(jié)果表明，本方法對Hg2+的定量分析具有較高的靈敏度和良好的線性度。

早期傳統(tǒng)的比色傳感系統(tǒng)由于缺乏有效的信號放大方法，只能識別nmol/L級的Hg2+ [15，26]。近年來建立的DNA探針介導(dǎo)Exo Ⅲ輔助的單循環(huán)靶標（Hg2+）回收利用策略，可以實現(xiàn)pmol/L水平的Hg2+檢測 [20，21]，上述方法僅僅使用了一個信號放大循環(huán)（Exo Ⅲ輔助Hg2+循環(huán)利用）。與現(xiàn)有的Hg2+含量分析方法相比（表2），本方法具有良好的檢測性能，這主要歸因于三重信號提升方式： Exo Ⅲ輔助Hg2+循環(huán)利用、Exo Ⅲ輔助Ⅰ區(qū)序列循環(huán)利用以及G-四鏈體-血紅素DNA酶的酶促催化信號放大。

3.5?實際樣品分析

分別采集湘江水、自來水以及湖水樣品，使用前過濾去除懸浮顆粒及雜質(zhì)。各樣品中分別添加0.5、 5.0、 50.0和100.0 pmol/L Hg2+。采用本方法進行測定，檢測結(jié)果如表3所示，3種不同來源水體樣品的加標回收率在96.0%～106.0%之間。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測定了水體樣品中的Hg2+濃度，使用的ICP-MS方法由于靈敏度的限制，能夠準確定量的Hg2+添加濃度為50.0 pmol/L和100.0 pmol/L，其結(jié)果與本方法檢測結(jié)果的相對誤差為5.3%～6.0%。結(jié)果表明， ICP-MS測定值與本方法的測定值沒有顯著差異，說明本方法具有良好的準確度和靈敏度，能夠滿足環(huán)境水體中 Hg2+檢測的要求。

4?結(jié) 論

基于Hg2+觸發(fā)的核酸探針末端結(jié)合、核酸外切酶Ⅲ輔助的靶目標雙循環(huán)再利用信號放大以及G-四鏈體-血紅素DNA酶酶促催化信號放大，設(shè)計并構(gòu)建了一種免標記、超靈敏的雙發(fā)夾探針介導(dǎo)的靶目標雙循環(huán)等溫信號放大新技術(shù)， 用于Hg2+的比色傳感。本方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，對環(huán)境水體樣品具有良好的檢測性能，可用于環(huán)境檢測領(lǐng)域現(xiàn)場分析技術(shù)的開發(fā)。

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