基于神經(jīng)化學(xué)分析研究炮制對人參和西洋參藥性的影響

黃鑫 王妮 張娜 越皓 劉淑瑩

摘?要?基于神經(jīng)化學(xué)分析，采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)，考察了人參、西洋參及其炮制品紅參、西洋紅參對大鼠血漿中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的影響。結(jié)合化學(xué)計量學(xué)多元統(tǒng)計分析，采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用判別函數(shù)對溫涼藥性進(jìn)行識別，篩選溫涼藥性潛在特征標(biāo)記物;利用識別模型獲得各味中藥對應(yīng)標(biāo)記物特征值分布，評價人參、西洋參及其炮制品藥性差異。結(jié)果表明，基于此神經(jīng)化學(xué)分析方法，共篩選出14種溫性標(biāo)記物和10種涼性標(biāo)記物，其中谷氨酸和苯丙氨酸對溫性藥性影響最大，甘氨酸和5-羥色胺與涼性相關(guān)性最大。紅參組與人參組中溫性藥性標(biāo)記物所對應(yīng)的特征值均為正值且紅參組大于人參組，即紅參藥性為溫，且在藥性上溫的程度甚于人參。西洋參組與西洋紅參組中涼性藥性標(biāo)記物所對應(yīng)的特征值均為正值，且西洋參組大于西洋紅參組，即西洋紅參在藥性上涼的程度不及西洋參，揭示了炮制對西洋參藥性的影響。結(jié)果表明，神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的變化可以反映中藥溫、涼藥性對生物體的影響，神經(jīng)化學(xué)分析可用于評價中藥的藥性效應(yīng)，為中藥藥性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效作用機制研究提供方法學(xué)借鑒。

關(guān)鍵詞?神經(jīng)化學(xué); 人參; 西洋參; 藥性

1?引 言

人參Panax ginseng C. A. Mey與西洋參Panax quinquefolium L.同為五加科人參屬植物，二者主要藥效成分為皂苷類化合物，但所含皂苷的種類、含量及組成不同。人參皂苷對神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等具有雙向調(diào)節(jié)作用[1]。中藥藥性是中藥作用于生物體所產(chǎn)生的效應(yīng)，包括寒、熱、溫、涼4種基本屬性，還有微溫、微涼等，各藥性只是程度上的差異，不存在本質(zhì)區(qū)別[2]。人參性溫，味甘、微苦。西洋參性涼，味甘、微苦，凡欲用人參而不受人參之溫補者，皆可以西洋參代之。人參經(jīng)蒸制加工得到的炮制品為紅參，其性較人參更溫，味甘、微苦。西洋參最常見的加工品為生曬西洋參，而對于其蒸制加工品西洋紅參的研究鮮見報道。西洋紅參的藥性和藥效也尚不明確。因此，研究西洋紅參的藥性和主要功效，對于擴(kuò)大西洋參的臨床應(yīng)用具有重要的意義。

中藥藥性是中藥有效成分作用于機體的共性靶標(biāo)而產(chǎn)生生物效應(yīng)的高度概括，與中藥化學(xué)成分和密切相關(guān)，通過特定生物效應(yīng)體現(xiàn)。中藥藥性研究的方法主要有：從生物熱力學(xué)角度，采用微量量熱法探討藥性差異[3]; 建立冷熱板示差法，從物質(zhì)-能量代謝角度，初步闡明二者藥性差異的客觀真實性[4，5]; 將神經(jīng)-內(nèi)分泌功效網(wǎng)絡(luò)結(jié)合寒證、熱證中醫(yī)臨床表現(xiàn)，探討表征藥性分析方法[6～8]; 以典型寒熱中藥為例，利用統(tǒng)計學(xué)和模式識別方法，基于模型判別系數(shù)和標(biāo)記特征值分布篩選標(biāo)記藥性的初生物質(zhì)成分并識別藥性寒熱程度[9～11]。神經(jīng)化學(xué)是一門新興的交叉學(xué)科，將神經(jīng)學(xué)與化學(xué)結(jié)合起來，研究機體內(nèi)分泌的多種微量化學(xué)物質(zhì)，主要包括氨基酸類和生物原胺類，這些神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在中樞神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌等系統(tǒng)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)節(jié)作用[12～15]。中藥寒熱藥性對神經(jīng)-內(nèi)分泌功效網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)影響研究表明，溫?zé)崴幙墒箘游锝桓猩窠?jīng)-腎上腺功能增強、興奮下丘腦-垂體-甲狀腺軸; 而寒涼藥則反之，表明神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)對機體神經(jīng)內(nèi)分泌功能有重要調(diào)控作用，與機體寒熱狀態(tài)關(guān)系密切[6～8，16，17]，對評價中藥藥性具有重要意義。已報道研究對于神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的檢測采用酶聯(lián)免疫法、熒光分光光度法、高效液相色譜-電化學(xué)法等。本研究應(yīng)用建立的高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，同時快速檢測大鼠血漿中24種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)含量，此方法的靈敏度、準(zhǔn)確性更高，更有利于全面反映藥性差異對于神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控作用的影響。基于此神經(jīng)化學(xué)分析，采用多元統(tǒng)計模式識別方法，篩選出與藥性相關(guān)的內(nèi)源性潛在特征標(biāo)記物，利用標(biāo)記物特征值分布差異，進(jìn)而識別西洋紅參的藥性，探討炮制方法對西洋參藥性的影響，為中藥藥性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用研究提供方法學(xué)借鑒。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀-TSQ Endura三重四極桿質(zhì)譜儀（Thermo Scientific公司）; Hypercarb色譜柱（100 mm × 2.1 mm，5 μm）、80℃低溫冰箱（Thermo Scientific公司）; BSA224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）; Bio-Gen PRO 200型精密勻漿器（PRO Scientific公司）; Eppendorf AG 22331 Hamburg離心機（德國Eppendorf公司）; Vortex-Genie2渦旋振蕩器（Scientific Industries公司）。

多巴胺（H110868）、腎上腺素（L137183）、去甲腎上腺素（N107258）、5-羥色胺（S111161）、5-羥基吲哚乙酸（H133485）、酪氨酸（T103976）、甘氨酸（A110749）、谷氨酸（G103978）、谷氨酰胺（G105425）、天冬氨酸（A108708）、牛磺酸（T103829）、絲氨酸（S103483）、組胺（H110868）、3，4-二羥基苯乙二醇（D9753）對照品購于阿拉丁試劑公司; 色氨酸（231123）、乙酰膽堿（A0084）、褪黑素（211835）、苯丙氨酸（125942）、3-甲氧基酪胺（913916）、3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇（H946340）、3，4-二羥基扁桃酸（D0582）、4-羥基-3-甲氧基扁桃酸（73538）、高香草酸（ASB-00008328-100）、3，4-二羥基苯乙酸（ASB-00004635-100）對照品均購于百靈威試劑公司; 甲醇、甲酸和乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）。實驗用水為Milli-Q超純水。

鮮人參和鮮西洋參（4年生）購自吉林省撫松縣，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為五加科人參屬人參Panax ginseng C. A. Mey和西洋參Panax quinquefolium L.干燥根。人參和西洋參經(jīng)鮮參烘干，實驗室自制。紅參和西洋紅參經(jīng)鮮參蒸制后烘干，實驗室自制。

SD大鼠（SPF級，雄性，180～200 g），購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK（遼）2015-0001。本實驗經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2.2?實驗方法

2.2.1?色譜與質(zhì)譜條件?（1）色譜條件?流動相： 0.1%甲酸-甲醇; 流速： 0.2 mL/min; 柱溫： 25℃; 進(jìn)樣量： 2 μL; 梯度洗脫： 0～3 min，0%甲醇; 3～10 min，0%～100%甲醇; 10～12 min，100%～0%甲醇。（2）質(zhì)譜參數(shù)?電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應(yīng)離子通道檢測（MRM），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，離子傳輸管溫度為300℃; 霧化器溫度為300℃; 鞘氣流速40 arb; 輔助氣流速10 arb。

2.2.2?對照品溶液與藥材樣品的制備?分別稱取多巴胺（DA）、 腎上腺素（E）、 去甲腎上腺素（NE）、 5-羥色胺（5-HT）、 5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）、 酪氨酸（Tyr）、 甘氨酸（Gly）、 谷氨酸（Glu）、 谷氨酰胺（Gln）、 天冬氨酸（Asp）、 牛磺酸（Tau）、 絲氨酸（Ser）、 組胺（His）、 3，4-二羥基苯乙二醇（DHPG）、 色氨酸（Try）、 乙酰膽堿（Ach）、 褪黑素（Mel）、 苯丙氨酸（Phe）、 3-甲氧基酪胺（3-MT）、 3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇（MHPG）、 3，4-二羥基扁桃酸（DOMA）、 4-羥基-3-甲氧基扁桃酸（VMA）、 高香草酸（HVA）、 3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）對照品各5 mg，以0.1%甲酸溶解并定容至5 mL，配成濃度為1 mg/mL溶液。用甲醇稀釋配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將藥材粉碎成細(xì)粉（過80目篩），稱取藥材粉末300 g，加入8倍量75%乙醇回流提取2次，第一次2 h，第二次1.5 h，濾過，合并兩次濾液，50℃水浴蒸干，并制備成凍干粉，即得各藥材總皂苷提取物，用于配制動物實驗灌胃給藥溶液。

2.2.3?動物實驗及樣本處理?適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為空白對照組、 人參組、 紅參組、 西洋參組和西洋紅參組。生藥4 g/kg，20 mL/kg灌胃給藥，對照組灌胃給予蒸餾水，每天1次，連續(xù)8周。

斷頭處死大鼠，取血漿并于冰浴中靜置10 min， 于4℃以12000 r/min離心20 min，取上清液。取100 μL血清，加入400 μL乙腈，振蕩1 min，靜置10 min，于4℃以12000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，待測。

2.2.4?數(shù)據(jù)統(tǒng)計?采用多元統(tǒng)計分析軟件（SIMCA-P + 13.0），以各組所測神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量為統(tǒng)計變量，進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別模式識別分析（PLS-DA）。

3?結(jié)果與討論

3.1?神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測分析方法評價

在前期研究工作基礎(chǔ)上，建立24種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析方法[17，18]，質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示。配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，各待測物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)如表1所示。各待測物的日內(nèi)精密度RSD為0.9%～9.0%，連續(xù)測定3日，日間精密度RSD為1.1%～9.0%，準(zhǔn)確度RSD為2.9%～7.0%，加樣回收率為97.5%～103.9%，結(jié)果表明，各待測物的精密度和準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性滿足分析要求。

3.2?大鼠血漿中神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分布變化分析

24種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在不同組別大鼠血漿中的含量經(jīng)高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定，采用多元統(tǒng)計分析（SIMCA-P + 13.0）方法處理數(shù)據(jù)。以各組所測神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量為統(tǒng)計變量，進(jìn)行主成分分析（PCA），對所有樣本進(jìn)行整體評價和區(qū)分，以第一主成分和第二主成分為坐標(biāo)軸構(gòu)建樣品的得分散點圖（圖1）。第一主成分和第二主成分可代表94.6%的變量信息，即包含了絕大部分的樣本信息。由圖1可見，空白對照組、人參組、紅參組、西洋參組和西洋紅參組區(qū)分良好，并且組內(nèi)相對集中，因此，這4種藥材皂苷組分對神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的含量變化可以反映中藥溫、涼藥性對生物體的影響，可用于評價中藥的藥性作用。

3.3?基于神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的人參、西洋參溫涼藥性特征標(biāo)記

Zhou等[12]基于典型寒熱中藥初生物質(zhì)成分建立偏最小二乘模型，利用判別系數(shù)成功識別中藥藥性特征標(biāo)記物。本研究在此基礎(chǔ)上，將偏最小二乘判別模式識別模型（PLS-DA）應(yīng)用于生物內(nèi)源性標(biāo)記物的統(tǒng)計分析來識別中藥溫涼藥性，獲得基于神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的溫涼藥性相關(guān)特征標(biāo)記物。以識別模型的判別系數(shù)作藥性相關(guān)特征標(biāo)記的可視化圖，見圖2，序號1～24分別代表表1中按相對保留時間排序的24種標(biāo)記物。

由圖可見，24種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)中與14種藥性標(biāo)記物的判別系數(shù)為正值： 即18： ?Glu、24： ?Phe、17： ?Asp、 1： ?VMA、 2： ?DOMA、 16： ?Gln、 8： ?E、 10： ?Tau、 23： ?3-MT、 22： ?Tyr、 5： ?Ach、 19： ?NE、 21： ?DA、 3： ?DHPG，可判斷其為溫性標(biāo)記; 而10種藥性標(biāo)記物的判別系數(shù)為負(fù)值： 即6： ?Gly、12： ?5-HT、13： ?HVA、9： ?Mel、4： ?His、7： ?Ser、20： ?DOPAC、14： ?5-HIAA、15： ?Try、11： ?MHPG，可判斷其為涼性標(biāo)記。溫性標(biāo)記物中Glu的判別系數(shù)最大，表明其對溫性藥性影響最大，其次為Phe，而DHPG因判別系數(shù)僅為0.0015，對溫性藥性影響不顯著; 同理Gly與涼性標(biāo)記正相關(guān)且相關(guān)性最大，其次為5-HT，而MHPG的相關(guān)性并不顯著。中藥對溫性標(biāo)記物和涼性標(biāo)記物不同程度的影響即可顯示其不同溫涼藥性特征。

經(jīng)判別系數(shù)識別的14種溫性藥性標(biāo)記物中，Glu由Gln在谷氨酰胺酶的作用下水解生成，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位，Gln是大腦的一種能量來源，可改進(jìn)維持大腦機能。Phe與Tyr一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機體糖代謝和脂肪代謝。Asp能調(diào)節(jié)腦和神經(jīng)的代謝功能。NE甲基化形成E，對心、血管活動、體溫、情緒等多種生理功能起到調(diào)節(jié)。Tau可改善機體內(nèi)分泌系統(tǒng)的狀態(tài)，對機體代謝進(jìn)行有益調(diào)節(jié)。3-MT調(diào)節(jié)垂體分泌，對心血管活動起興奮作用。Ach主要參于機體心血管活動、攝食、飲水、睡眠、覺醒、感覺和運動的調(diào)節(jié)[19]。DA參與多種感覺和情緒等生理功能的調(diào)節(jié)，有提高機體抗應(yīng)激能力和抗抑郁的作用。綜上可見， 溫性藥性標(biāo)記物具有促進(jìn)機體能量代謝，改進(jìn)機體內(nèi)分泌系統(tǒng)功能，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性等生物活性，決定了溫?zé)崴幠軌蛘{(diào)理寒涼證。

而涼性藥性標(biāo)記物Gly是一個抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。Ser可以抑制神經(jīng)元興奮性毒性，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)作用。5-HT是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動的一種重要的抑制性神經(jīng)物質(zhì)，參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能的調(diào)節(jié)。Mel有強大的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)活性和清除自由基抗氧化能力。Try是5-HT的前體，5-HIAA作為5-HT的代謝產(chǎn)物以及5-HT可經(jīng)過轉(zhuǎn)化合成為Mel，它們可削弱應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)精神節(jié)律和改善睡眠。His是一種化學(xué)傳導(dǎo)物質(zhì)，參與睡眠、激素分泌、體溫調(diào)節(jié)、食欲等功能?？梢娮R別出的涼性藥性標(biāo)記物都具有降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性作用，減弱代謝和應(yīng)激反應(yīng)能力，從而顯示寒涼的生物活性。

3.4?基于神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的西洋紅參藥性標(biāo)記識別

Zhou等[12]的研究表明，利用特征標(biāo)記物的特征值分布可判別中藥藥性差異。本研究在此基礎(chǔ)上，采用PLS-DA模式識別方法計算各標(biāo)記物的特征值并進(jìn)行比對，以14種溫性標(biāo)記物和10種涼性標(biāo)記物的特征值做圖。如圖3所示，溫性標(biāo)記物和涼性標(biāo)記物在人參、紅參、西洋參、西洋紅參各組中特征值分布存在明顯差異，并且特征值的大小與藥性溫涼程度具有相關(guān)性。

圖3A為人參組各藥性標(biāo)記物特征值分布，溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為正值，而涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為負(fù)值，因此，人參表現(xiàn)為溫性。圖3B為紅參組各藥性標(biāo)記物特征值分布，溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為正值，而涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為負(fù)值，可判斷紅參為溫性。紅參組中溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值明顯大于人參組，而涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值明顯小于人參組，此結(jié)果表明紅參在藥性上溫的程度要甚于人參，與中醫(yī)認(rèn)為人參性微溫而紅參性溫的藥性觀點相一致。因此，應(yīng)用篩選出的24種標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值分布情況可以判斷中藥藥性溫涼的程度。

與上述結(jié)果相似，從西洋參組各藥性標(biāo)記物特征值分布（圖3C）可知，涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為正值，而溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為負(fù)值，因此，西洋參表現(xiàn)為涼性。西洋紅參組各藥性標(biāo)記特征值分布圖（圖3D）中涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為正值，溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為負(fù)值，可判定西洋紅參也表現(xiàn)為涼性。與西洋參組相比較，西洋紅參組中涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值明顯小于西洋參組，而溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值與西洋參組差異不明顯，由此推斷西洋紅參在藥性上涼的程度不及西洋參。

對比西洋紅參組與人參組各藥性標(biāo)記物特征值分布圖，人參組溫性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為正值，而西洋紅參組涼性標(biāo)記神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)所對應(yīng)的特征值為正值，可以判定，炮制后的西洋紅參的藥性較西洋參稍溫，但其整體藥性仍表現(xiàn)為涼性，而人參則表現(xiàn)為溫性。

4?結(jié) 論

基于神經(jīng)化學(xué)分析，應(yīng)用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計模式識別方法，對人參、西洋參及其炮制品的藥性進(jìn)行研究。篩選出與溫性相關(guān)的潛在特征標(biāo)記物14種，與涼性相關(guān)的潛在特征標(biāo)記物10種。通過對特征標(biāo)記物的可視化分析和特征值分布差異分析，印證了傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為紅參在藥性上溫的程度要甚于人參的觀點，同時推測出西洋紅參藥性為涼并且涼的程度不及西洋參，揭示了炮制對西洋參藥性的影響。篩選出的藥性相關(guān)生物標(biāo)記物具有調(diào)節(jié)機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)功能、調(diào)節(jié)能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)能力等方面的生物活性，與中藥寒熱藥性對神經(jīng)-內(nèi)分泌功效網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)影響研究結(jié)果一致。本研究將神經(jīng)化學(xué)分析方法應(yīng)用于中藥藥性評價，以近緣中藥人參和西洋參為例，利用PLS-DA模式識別方法，基于模型判別系數(shù)和標(biāo)記特征值分布篩選標(biāo)記藥性的內(nèi)源性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)并識別藥性溫涼程度，為進(jìn)一步深入探討中藥藥性差異的物質(zhì)基礎(chǔ)和藥效作用機制研究提供了方法學(xué)借鑒。

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