富鍶水體處理對大黃魚耳石和肌體中鍶含量的影響

張 輝，姜亞洲，袁興偉，張 翼，蔣宏雷，焦海峰，程家驊，李圣法

（1．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠(yuǎn)洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2．寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315012）

大黃魚（Larimichthys crocea）是我國近海重要的增殖放流品種，其增殖放流工作開展已有10余年的歷史［1］?；阪J元素的耳石元素指紋標(biāo)記是研建小規(guī)格大黃魚增殖放流苗種規(guī)?；瘶?biāo)記技術(shù)的重要探索方向［2-5］。該項(xiàng)標(biāo)記技術(shù)主要通過階段性提升增殖放流魚苗飼養(yǎng)水體中鍶元素濃度，使其在處理魚苗特定耳石區(qū)位富集，進(jìn)而達(dá)到對處理魚苗耳石元素指紋標(biāo)記的目標(biāo)。目前，對于該方面的研究報道較多，我國學(xué)者先后報道了大麻哈魚（Oncorhynchus keta）［6］、黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）［7］、鳙 （Aristichthys nobilis）［8］等物種的鍶元素耳石元素指紋標(biāo)記。張輝等［9］也通過富鍶水體浸泡標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，從耳石元素指紋標(biāo)記建立角度對利用該項(xiàng)技術(shù)開展大黃魚魚苗標(biāo)記的可行性進(jìn)行了實(shí)證研究。但該研究由于未能動態(tài)跟蹤標(biāo)記處理后耳石和肌體中鍶元素含量的變化規(guī)律，致使耳石元素指紋標(biāo)記的穩(wěn)定性問題和標(biāo)記過程是否會因提升受試魚苗肌體中鍶元素濃度進(jìn)而引發(fā)食品安全問題等均有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

鑒于此，本研究擬通過開展富鍶水體對大黃魚魚苗的浸泡標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，在系統(tǒng)分析受試魚苗耳石Sr／Ca值對富鍶水體標(biāo)記過程的響應(yīng)方式、探究耳石元素指紋標(biāo)記穩(wěn)定性的同時，動態(tài)跟蹤受試魚苗肌體和主要臟器中鍶含量的變化規(guī)律，以期明確標(biāo)記過程是否存在相關(guān)食品安全性風(fēng)險。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)用大黃魚取自浙江省象山縣象山灣大黃魚苗種繁育中心，為育苗后28 d的幼魚。實(shí)驗(yàn)使用6個1 000 L的圓柱形黑桶，其中3個桶為處理組，另3個桶為對照組，每個桶中置有大約5 000尾大黃魚幼魚，養(yǎng)殖用水為經(jīng)過三級處理后的天然海水。養(yǎng)殖期間的水溫為20．7～23．0℃，鹽度為 27．0～27．5，pH值保持在 7．8～8．5之間。育苗室的光強(qiáng)控制在1 000 lx以下。每個桶內(nèi)均勻放置2個充氣石，保持水中氧氣充足。餌料主要投喂天然海區(qū)捕撈的活橈足類。根據(jù)實(shí)驗(yàn)前的海水測定，該苗種繁育中心的海水Sr2+濃度為（6．07±0．68）mg·L-1。據(jù)張翼等［7］研究發(fā)現(xiàn)，受試魚苗成功標(biāo)記的判別標(biāo)準(zhǔn)為任意點(diǎn)位Sr／Ca值均超過標(biāo)記檢測基線（即對照相應(yīng)耳石區(qū)位Sr／Ca值均值與其3．3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和）。鑒于此，本研究中處理組選用原海水3倍Sr2+濃度的富鍶海水，每次換水后，在處理組中加入一定量的SrCl2·6H2O來調(diào)節(jié)Sr2+的濃度，使得處理組水中的Sr2+濃度保持在18mg·L-1。實(shí)驗(yàn)時間為2015年3月29日—4月4日，共7d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將各組大黃魚幼魚移至網(wǎng)箱暫養(yǎng)。

1．2 樣品采集

實(shí)驗(yàn)樣品的采集包括實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)期間、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后期3部分：

1）實(shí)驗(yàn)前，從3個處理組和3個對照組中隨機(jī)采集大黃魚幼魚樣品各30尾，處理組和對照組分別用T-0和C-0表示（數(shù)字表示實(shí)驗(yàn)的天數(shù)，以下同）。

2）實(shí)驗(yàn)期間，采集最后一天大黃魚幼魚，采集的樣品包括處理組和對照組的6個桶，每個桶各采集30尾樣品，處理組和對照組分別用T-7和C-7表示。

3）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，分11次采集大黃魚幼魚的樣品，第1次為實(shí)驗(yàn)開始后的第8天采集，第2～10次為之后每隔3 d采集一次樣品，第11次即最后一次為實(shí)驗(yàn)開始后的第66天采集樣品。每次采集的樣品包括處理組和對照組的6個桶，每個桶各采集30尾樣品。第1次采集的樣品處理組和對照組分別用T-8和C-8表示，其后的樣品處理組和對照組后面的數(shù)字分別以實(shí)驗(yàn)開始后的天數(shù)來表示。采樣時間以及處理組與對照組的平均體長見圖1。

圖1 大黃魚處理組與對照組的平均體長變化Fig．1 Variations of average body length between treatment group and control group of Larimichthys crocea

1．3 元素分析

1．3．1 儀器和試劑

肌體消融主要通過SCP DigiPREP石墨消解儀進(jìn)行消融，肌體元素分析采用Thermo X Series II ICPMS（Thermo Fisher Scientific， Bremen，Germany），耳石元素通過LA-ICPMS進(jìn)行分析。

肌肉元素分析需要的試劑包含：1）釔標(biāo)準(zhǔn)溶液：1g·L-1，硝酸（2+98）介質(zhì)；2）內(nèi)標(biāo)溶液：取1g·L-1釔標(biāo)準(zhǔn)溶液0．25 mL，加異丙醇10 mL，硝酸10 mL，用水定容至 500 mL，配成含釔 500 μg·L-1的溶液，常溫下可保存至少3個月；3）質(zhì)譜調(diào)諧液：選取10μg·L-1的鋁、鎂、銠、釔溶液為質(zhì)譜調(diào)諧液，硝酸（2+98）介質(zhì)。

1．3．2 樣品處理

1）耳石處理：樣品處理時，首先取出大黃魚幼魚的矢耳石，參照張翼等［10］的方法將耳石包埋、研磨和拋光，制成厚度約為0．5 mm左右的薄片，用于后續(xù)的分析。

2）肌體處理：包括對大黃魚幼魚鰓、腎臟、肝臟和肌肉采集，其中肌肉每次均采集，而鰓、腎臟和肝臟由于分量太輕，不能達(dá)到ICPMS儀器的檢測最低限，因此只采集最后一次個體較大的。采集后的樣本分別進(jìn)行常壓消解，消解的樣本每份在0．50～2．00 g之間，將消解的樣本置于消解罐中后，加入7 mL硝酸，然后將消解罐置于石墨消解儀上進(jìn)行消解，消解流程參數(shù)見表1。消解結(jié)束后，待樣本溶液冷卻至室溫，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL比色管，用去離子水定容混勻，測定前用去離子水稀釋10倍。

表1 常壓消解流程參數(shù)Tab．1 Parameters of processing under normal peressure

1．3．3 樣本分析

儀器點(diǎn)火穩(wěn)定后，通過X-Y軸旋鈕調(diào)節(jié)炬管位子，并改變等離子條件，使調(diào)諧元素的靈敏度及穩(wěn)定性最佳且干擾最小。

1）耳石元素分析：采用激光線掃描測量，具體的耳石元素檢測方法參照張翼等［10］的方法進(jìn)行。

2）肌體元素分析：根據(jù)樊祥等［11-12］的研究，先將標(biāo)準(zhǔn)溶液引入儀器，再將試劑空白溶液、樣本溶液引入儀器，在線加入內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行測定，將測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。根據(jù)樣本溶液中鍶的信號強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算大黃魚幼魚樣本中鍶的含量。

1．4 數(shù)據(jù)分析

為了反映處理組和對照組標(biāo)記時間段耳石Sr／Ca值之間以及處理組和對照組在標(biāo)記過程和標(biāo)記之后的肌肉、鰓、肝臟、腎臟鍶含量之間的差異，本研究利用SPSS 19．0軟件系統(tǒng)中的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分別對其之間的差異進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 Sr／Ca值組成

通過ICPMS檢測發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)前，所有的大黃魚幼魚耳石在離耳石核心0～0．20 mm處，鍶含量均較高，且不穩(wěn)定；處理組和對照組耳石中的Sr／Ca并沒有明顯的差別。經(jīng)過7 d的富鍶水體浸泡處理，可以發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，處理組大黃魚幼魚的耳石在距離耳石核心0．30 mm處鍶含量開始出現(xiàn)上升的趨勢，且在距離耳石核心0．40～0．50 mm處達(dá)到最高峰，并在該區(qū)段處于穩(wěn)定趨勢。隨著富鍶水體浸泡實(shí)驗(yàn)的結(jié)束，在距離耳石核心0．50 mm之后開始出現(xiàn)下降趨勢，直至距離耳石核心0．60 mm處，回落至對照組水平（圖2）。該區(qū)段處理組與對照組的Sr／Ca值分別為（3．42±0．90）mmol·mol-1和（1．52±1．52）mmol·mol-1。對處理組在該區(qū)段的Sr／Ca均值通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)表明，處理組與對照組之間的 Sr／Ca值有著極顯著差異（P＜0．01）。檢測結(jié)果同時表明，在處理組的所有樣品中，在距離耳石核心0．30～0．60 mm區(qū)段存在該峰值的樣品魚達(dá)到100%。

圖2 處理組和對照組的鍶鈣比值Fig．2 Value of Sr／Ca in treatment and control groups

2．2 肌肉的鍶含量

利用ICPMS進(jìn)行檢測分析，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)得出，實(shí)驗(yàn)前，大黃魚幼魚處理組和對照組肌肉中的鍶含量差異不顯著（P＞0．05）。富鍶水體處理的最后一天，大黃魚幼魚處理組和對照組肌肉中的鍶含量差異顯著（P＜0．05），處理組肌肉中的鍶元素平均含量是對照組的2倍多（圖3）。實(shí)驗(yàn)開始后35d內(nèi)的處理組與對照組肌肉中的鍶含量差異均顯著（P＜0．05），從圖3中可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的4 d內(nèi)，處理組肌肉中的鍶元素平均含量基本處于穩(wěn)定的狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第7天已經(jīng)有所下降，且在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后28 d內(nèi)一直處于下降的趨勢。實(shí)驗(yàn)開始后第66天，處理組和對照組的大黃魚肌肉中鍶含量差異不顯著（P＞0．05）。

2．3 鰓、腎臟和肝臟的鍶含量

鑒于規(guī)格較小的大黃魚幼魚鰓、肝臟和腎臟重量均達(dá)不到ICPMS的檢測限，為了確定富鍶水處理的大黃魚幼魚的鰓、腎臟和肝臟是否含有殘留的高濃度鍶，本研究采集了30尾實(shí)驗(yàn)開始后第66天大黃魚幼魚的鰓、腎臟和肝臟進(jìn)行元素檢測，經(jīng)ICPMS檢測分析后，利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對處理組和對照組的鍶元素含量的差異性檢驗(yàn)結(jié)果表明，處理組和對照組的大黃魚鰓、腎臟和肝臟中鍶元素的含量差異均不顯著（P＞0．05）。

3 討論

小規(guī)格的苗種規(guī)?；瘶?biāo)記一直是困擾我國增殖放流效果評價的主要難題。傳統(tǒng)的標(biāo)記方法大多適合于個體較大的魚類，而且還面臨工作量大、死亡率高、標(biāo)簽易脫落等缺點(diǎn)［13］。基于鍶元素的耳石指紋標(biāo)志技術(shù)作為魚類標(biāo)志放流研究領(lǐng)域中的新興技術(shù)，不僅克服了傳統(tǒng)方法上的缺點(diǎn)，而且是一種對苗種規(guī)格限制小、便于規(guī)模化操作、無標(biāo)記操作損傷、標(biāo)記終生攜帶的方法［14-15］。本研究通過開展富鍶水體對大黃魚魚苗浸泡標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了富鍶水體對大黃魚增殖放流魚苗耳石元素指紋標(biāo)記效果，明確了富鍶水體處理的大黃魚魚苗放流后在肌體中的鍶殘留狀況，驗(yàn)證了該項(xiàng)技術(shù)對于小規(guī)格的大黃魚魚苗規(guī)模化標(biāo)記的可行性。

3．1 富鍶水對大黃魚幼魚耳石鍶含量的影響

從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，大黃魚幼魚耳石核心處的鍶含量較高，很可能是由于親體對幼體的母體效應(yīng)。在其出膜的第28天，耳石中的鍶含量達(dá)到了穩(wěn)定初期。因此，筆者認(rèn)為大黃魚出膜的第28天是適合進(jìn)行鍶元素標(biāo)記的。根據(jù)研究的結(jié)果還可發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)初期，大黃魚幼魚耳石中的鍶含量不斷增加，隨著時間的推移達(dá)到一個峰值，最后趨于穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，隨著水環(huán)境中Sr2+濃度趨于正常，處理組大黃魚幼魚耳石中的Sr／Ca值出現(xiàn)下降的趨勢，該趨勢在實(shí)驗(yàn)開始后的第17天后趨于穩(wěn)定。鑒于此，可以確定經(jīng)富鍶水體處理的大黃魚幼魚個體在特定的耳石區(qū)段形成的峰可作為區(qū)分放流群體和自然群體穩(wěn)定的鍶標(biāo)記，而其適合標(biāo)記的時間為出膜后的第28天至轉(zhuǎn)移到網(wǎng)箱養(yǎng)殖前。

圖3 大黃魚處理組和對照組肌肉鍶元素平均含量變化趨勢Fig．3 Variation trend of Sr between treatment group and control group in Larimichthy scrocea

3．2 富鍶水對大黃魚幼魚肌體鍶含量的影響

鍶是一種低毒的微量元素［16］，標(biāo)記放流的大黃魚魚苗在放流后隨著時間的推移有一部分會被人類回捕且用于食用?，F(xiàn)階段，我國對于鍶元素的水產(chǎn)品食用安全還沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。藺艷等［17-18］研究發(fā)現(xiàn)高鍶礦泉水在鍶濃度不超過8 mg·L-1時對細(xì)胞增殖有益，其中鍶濃度為4 mg·L-1的效果最突出，主要以延長其增殖周期為主。美國環(huán)境保護(hù)局規(guī)定公共飲用水穩(wěn)態(tài)鍶上限濃度為4 mg·L-1［19］。為了避免富鍶水處理的大黃魚所帶來的相關(guān)水產(chǎn)品安全問題，在放流前，標(biāo)記個體的肌體中的鍶含量應(yīng)盡量與對照個體保持一致。

根據(jù)本研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過7 d的18 mg·L-1富鍶水體處理，實(shí)驗(yàn)處理組大黃魚幼魚的肌肉中鍶元素含量最高時達(dá)到了110mg·L-1左右。雖然鍶對人體的致死量目前還不清楚，但這一濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了正常人體鍶的攝入量，因此該階段的大黃魚作為人類的食物而言是不安全的。隨著時間的推移，實(shí)驗(yàn)處理組中的大黃魚幼魚肌肉中的鍶元素含量開始呈現(xiàn)出不斷衰退的趨勢。實(shí)驗(yàn)開始后的第66天，處理組的大黃魚幼魚肌肉中鍶元素含量已降低至正常值。

鰓是魚體的吸收和排泄器官，腎臟是魚體的排泄器官，肝臟則是魚體的解毒器官［19-20］。為了確定魚體各器官的鍶含量的變化，本研究檢測了經(jīng)18 mg·L-1富鍶水處理的大黃魚幼魚鰓、腎臟和肝臟鍶含量的變化。但由于實(shí)驗(yàn)中的大黃魚幼魚個體的鰓、腎臟和肝臟的重量均達(dá)不到ICPMS的檢測限，因此，只是對實(shí)驗(yàn)開始后第66天大黃魚幼魚的鰓、肝臟和腎臟進(jìn)行檢測，通過檢測，發(fā)現(xiàn)66d的處理組大黃魚幼魚鰓、肝臟和腎臟中鍶含量水平均達(dá)到了正常范圍。

根據(jù)浙江省大黃魚增殖放流技術(shù)規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)，可以發(fā)現(xiàn)大黃魚苗種放流的規(guī)格為平均體長不小于5cm［21］。從本研究的圖1可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)開始后的第66天大黃魚幼魚的體長為5 cm左右，達(dá)到了大黃魚放流的標(biāo)準(zhǔn)。鑒于上述，可以提議，在增殖放流效果標(biāo)記的過程中，可以把經(jīng)富鍶水處理的大黃魚進(jìn)行暫養(yǎng)，待其肌體中的鍶元素恢復(fù)正常水平后再進(jìn)行放流，確保消除富鍶水體處理過程中產(chǎn)生的鍶元素超標(biāo)而引起的食品安全隱患。