高權(quán)新，李云莉，齊占會(huì)，岳彥峰，施兆鴻，彭士明，高 陽

（1．湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000；2．浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；

3．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；4．中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 510300）

我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界水產(chǎn)養(yǎng)殖總量的70%以上，也是全球最大的海水養(yǎng)殖國家和世界上唯一一個(gè)養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家［1］。近年來，隨著我國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，污水入海、違規(guī)開發(fā)、藥物濫用等問題日益突出，導(dǎo)致近海海域污染持續(xù)加重，水產(chǎn)病害頻發(fā)。在巨大的海洋生態(tài)系統(tǒng)中，微生物是非常重要的組成部分，其結(jié)構(gòu)組成和代謝產(chǎn)物對(duì)環(huán)境具有指示作用［2］。微生物群落組成與海洋的水質(zhì)狀況聯(lián)系緊密，能間接反映出海洋的水體特征，并能影響海洋物種的生存和繁衍［3］。此外，水生環(huán)境淤泥中微生物群落是水生生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)因子循環(huán)和能量傳遞的主要驅(qū)動(dòng)力［4］，所以深入剖析微生物的群落組成與分布特征對(duì)于海洋微生物的生態(tài)學(xué)研究具有重要意義。

傳統(tǒng)的微生物結(jié)構(gòu)研究方法局限性在于僅對(duì)部分細(xì)菌或可培養(yǎng)細(xì)菌分布特點(diǎn)進(jìn)行分析［5］，近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境生物研究中的快速發(fā)展和應(yīng)用，國內(nèi)外專家學(xué)者紛紛利用最新的菌落鑒別技術(shù)對(duì)我國沿海微生物多樣性展開調(diào)研［6-9］。目前有關(guān)我國典型養(yǎng)殖水域微生物多樣性的研究尚較缺乏，且相關(guān)研究多局限在某一水域，沒有對(duì)我國重要海水養(yǎng)殖水域進(jìn)行全面、系統(tǒng)的深入分析［10］。為此，本實(shí)驗(yàn)采集了我國沿海10個(gè)養(yǎng)殖密集水域和1個(gè)無養(yǎng)殖活動(dòng)對(duì)照水域的底泥樣品，通過 de novo測序，借助IlluminaMiSeq測序平臺(tái)對(duì)所采集樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析，旨在為我國沿海養(yǎng)殖水域微生物研究和環(huán)境管理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 樣品采集

本研究于2015年9—10月從中國沿海養(yǎng)殖密集水域采集底泥樣品，所選取的10個(gè)典型海水養(yǎng)殖區(qū)域包括大連、唐山、蓬萊、連云港、啟東、象山、寧德、東山、湛江、陵水，并設(shè)美濟(jì)礁為對(duì)照水域（表1），美濟(jì)礁位于中國南海，該水域沒有養(yǎng)殖活動(dòng)，所以本研究將其作為對(duì)照。分別在每個(gè)水域10個(gè)不同的點(diǎn)進(jìn)行采樣，然后混合、攪勻，并將混合后的樣本作為這個(gè)水域的底泥樣進(jìn)行檢測分析。底泥樣品收集后，立即用密封袋封存，低溫運(yùn)輸，在本實(shí)驗(yàn)室-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 細(xì)菌的多樣性分析

提取樣品中的DNA，構(gòu)建文庫并測序。采用Illumina NextSeq 500測序平臺(tái)，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去接頭和質(zhì)量過濾，最后再進(jìn)行連接處理和拼接。所得序列與多個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)注釋并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)豐度。獲取注釋及豐度信息后，從物種豐度與基因豐度兩個(gè)角度進(jìn)行細(xì)菌的多樣性分析。

1．3 生物信息學(xué)分析

將有效數(shù)據(jù)在97%的相似水平上劃分為不同的OTU，將OTU代表序列與相應(yīng)的微生物數(shù)據(jù)庫比對(duì)，利用Greengene數(shù)據(jù)等數(shù)據(jù)庫對(duì)物種進(jìn)行注釋，從而得到每個(gè)樣本所含的物種信息。通過對(duì)OTUs進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)、豐度等分析，并對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，得到細(xì)菌群落的組成信息，再通過Beta多樣性分析，系統(tǒng)分析密集養(yǎng)殖水域底泥樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

1．4 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Uparse軟件進(jìn)行OTU聚類分析，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析；利用Qiime軟件、R軟件、Mothur軟件等進(jìn)行物種豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 Alpha多樣性分析

Chao指數(shù)和ACE指數(shù)可以用來描述整個(gè)群落的豐富度（不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以用來描述一個(gè)樣品的細(xì)菌多樣性。由表2可以看出，樣品ND的 Simpson指數(shù)最高，其次是樣品 DL；而Shannon指數(shù)值最高的是樣品DL，其次是樣品ND，并且兩個(gè)樣品的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)相差不大，說明這兩個(gè)區(qū)域的群落多樣性較高，這可能和這兩個(gè)區(qū)域的地理位置以及養(yǎng)殖品種相關(guān)。此外，樣品ND的Chao指數(shù)和ACE指數(shù)最高，分別為652．0和670．8，說明該區(qū)域的群落豐富度最高，其次是樣品DL。總的來說，各采樣點(diǎn)的群落豐富度和多樣性存在著一定的差異，其中以MJJ和QD的豐富度和多樣性最低。

表1 采樣點(diǎn)和主要養(yǎng)殖品種Tab．1 Sampling locations and major cultured species

表2 各采樣點(diǎn)生物多樣性指數(shù)Tab．2 Biodiversity index of each sampling site

2．2 群落結(jié)構(gòu)分析

由3D PCoA圖（圖1）可見，樣品LYG和QD之間有重疊的部分，這說明樣品LYG和QD的細(xì)菌群落組成相似。其次，樣品ND和DS之間的距離也較近，這表明樣品ND和DS的細(xì)菌群落組成差異較小，這與NMDS分析圖（圖2）顯示的結(jié)果一致。利用NMDS分析底泥細(xì)菌群落組成，壓力系數(shù)為0．012 647，說明可以較好地反映各采樣點(diǎn)間細(xì)菌群落的相似性。此外，樣品LS與其它樣品之間的距離都比較遠(yuǎn)，這說明LS與其它采樣點(diǎn)之間的微生物群落差異較大，這可能與當(dāng)?shù)氐酿B(yǎng)殖品種以及生態(tài)環(huán)境相關(guān)。

圖1 各采樣點(diǎn)樣品的3D PCoA圖Fig．1 3D PCoA figure of samples from each sampling site

圖2 各采樣點(diǎn)樣品NMDS分析圖Fig．2 NMDSanalysis chart of samples from each sampling site

為比較各樣品間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，本研究對(duì)11個(gè)樣品做了基于屬水平的主成分分析（principal components analysis，PCA圖，圖 3）；其中第1主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為 69．46%，第2主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為21．55%，兩者累積貢獻(xiàn)率為91．01%，因此能客觀反映各樣品間微生物群落結(jié)構(gòu)上的差異。如圖3所示，幾乎所有的點(diǎn)都位于圖的上方，除了樣品PL的點(diǎn)位于圖的下方，并且與其它點(diǎn)之間的距離較遠(yuǎn)，由此可知，樣品PL與其它樣品之間的細(xì)菌群落差異較大。

圖3 各采樣點(diǎn)樣品基于屬水平的主成分分析（PCA）Fig．3 Principal component analysis（PCA）of samples from each sampling site based on genus level

Heatmap可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，從而顯示每個(gè)樣品中細(xì)菌群落的多樣性（圖4）。從圖4可以看出，樣品DL、PL和XS都具有明顯且較大的紅色區(qū)域，這說明這些紅色區(qū)域所覆蓋的細(xì)菌數(shù)量較大，也就是這3個(gè)水域的底泥中含有較多高豐度的細(xì)菌；除了樣品MJJ之外，其它樣品都具有較小的紅色區(qū)域覆蓋。從整體上看，各樣品之間細(xì)菌群落的豐度差異較大。

由圖5可見，在門水平上細(xì)菌群落主要分為兩大類：厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）。其中大部分樣品中，厚壁菌門的群落豐富度高于變形菌門。這與圖6顯示的結(jié)果一致。在厚壁菌門中，桿菌綱（Bacilli）的細(xì)菌所占總菌的比例最高；另外在芽孢桿菌目（Bacillates）中，主要菌科是動(dòng)性球菌科（Planococcaceae）和芽孢桿菌科（Bacillaceae）。在屬水平上，占明顯優(yōu)勢的是芽孢桿菌屬（Bacillus）。在變形菌門中，群落豐度比較高的是變形菌綱（Gammaproteobacteria）中的假單胞菌目下的莫拉菌科（Moraxellaceae）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與我國的養(yǎng)殖水域相比，美濟(jì)礁水域（非養(yǎng)殖水域）微生物的豐富度和多樣性均較低，這說明我國沿海水域微生物的群系組成受水產(chǎn)養(yǎng)殖活動(dòng)影響巨大。因?yàn)槲覈睾Ｋa(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，每年都有大量的有機(jī)物質(zhì)、營養(yǎng)鹽、抗生素等輸入近海，這導(dǎo)致沿海水環(huán)境遭受嚴(yán)重污染［11-12］。有研究指出［13-14］，我國近海有機(jī)污染已明顯改變了浮游細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)。海水養(yǎng)殖過程中浪費(fèi)的餌料、水產(chǎn)動(dòng)物的排泄物和抗生素殘留以及人類的生活垃圾等都會(huì)增加底泥的有機(jī)物含量和藥物殘留，從而導(dǎo)致微生物的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。微生物群系是環(huán)境變化、波動(dòng)的首要響應(yīng)者，可用于評(píng)估自然或人為活動(dòng)對(duì)環(huán)境的影響。越來越多的專家學(xué)者建議將微生物群落的特征作為評(píng)價(jià)海洋生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定與健康的重要指標(biāo)［15］。戴文芳等［13］篩選了與有機(jī)物污染狀況顯著相關(guān)的23個(gè)菌科，并推薦將其作為潛在有機(jī)污染的指示種群。

本研究通過分析生物多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖水域底泥細(xì)菌群落的豐富度和多樣性存在著較大的差異。國外有學(xué)者對(duì)不同海域沉積物中的細(xì)菌群落做了多樣性分析，發(fā)現(xiàn)不同海域沉積物中細(xì)菌群落的豐富度存在著一定的差異［9-11］，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其相似。究其原因［11，16］，首先，不同的水域遭受有機(jī)物污染的程度不一，水體富營養(yǎng)化污染情況也復(fù)雜多樣，且水環(huán)境中的藥物殘留、總氮、硝酸鹽、溶解氧等環(huán)境因子可能存在較大的差異；環(huán)境因子的動(dòng)態(tài)變化會(huì)促使某些細(xì)菌成為優(yōu)勢菌，從而影響整個(gè)水生系統(tǒng)中細(xì)菌群落的組成［17］。其次，除了污染的因素外，微生物的群落組成還與沿海水域的諸多客觀因素有關(guān)，比如微生物所處水環(huán)境的溫度、鹽度、淤泥的質(zhì)地、浮游植物、氣候等等［18-23］。此外，除水產(chǎn)養(yǎng)殖外的人類活動(dòng)也會(huì)對(duì)水體中細(xì)菌的多樣性產(chǎn)生較大影響，比如海上交通、捕撈等都會(huì)顯著改變細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，所以有學(xué)者提議建立“海洋保護(hù)區(qū)”，以保存現(xiàn)有的微生物物種［15］。

從本研究的PCoA圖和NMDS圖可以看出，連云港和啟東兩個(gè)樣品中的細(xì)菌群落組成很相似，根據(jù)實(shí)地調(diào)查了解，兩個(gè)水域主要的養(yǎng)殖品種都是文蛤（Meretrix meretrix）和蝦蟹類，所以推測養(yǎng)殖品種的不同也可能是造成微生物群系差異的重要因素。因?yàn)轲B(yǎng)殖品種的食性、飼料類型、排泄廢物以及投放的藥物等皆有不同，養(yǎng)殖動(dòng)物腸道和水體中微生物群系也存在差異［24］，所以這可能間接導(dǎo)致了近海不同水域微生物群系的不同。

圖4 不同區(qū)域細(xì)菌的熱圖Fig．4 A heatmap of bacteria from different sites

變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包括多種致病菌和益生菌，有報(bào)道指出其在我國主要的河流和近海中分布非常廣泛，是水生系統(tǒng)中最大的一個(gè)門類［25-27］。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道［28-30］，變形菌門在我國遼河口、長江口和渤海灣水域中所占總菌的比例分別為 61．94%、50．62%、39．80%，是這些水域生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌群落豐度最大的一個(gè)門類。在國外亦有類似的報(bào)道，ZENG等［31］和ABIA等［32］均發(fā)現(xiàn)變形菌門是水生系統(tǒng)中比例最高的菌門；CATANIA等［15］發(fā)現(xiàn)變形菌門和厚壁菌門在地中海水域的分布最為廣泛，分別占到總菌的78%和11%。在本實(shí)驗(yàn)中，多樣品物種分布圖和物種群落結(jié)構(gòu)圖顯示，中國典型養(yǎng)殖水域淤泥中的細(xì)菌主要為厚壁菌門和變形菌門；且僅在唐山、湛江和美濟(jì)礁水域變形菌門所占總菌比例大于厚壁菌門，而在其它水域，厚壁菌門的比例明顯高于變形菌門，這種差異可能是由其所處的沿海水域地理位置的不同造成的。

圖5 不同養(yǎng)殖水域底泥細(xì)菌在門水平的相對(duì)豐度分析Fig．5 Relative abundance of bacteria in the level of door from different culture areas

圖6 物種群落結(jié)構(gòu)圖Fig．6 Species community structure

本研究發(fā)現(xiàn)，中國典型養(yǎng)殖水域中厚壁菌門的豐度要高于變形菌門，并且厚壁菌門中的芽孢桿菌是優(yōu)勢菌種。芽孢桿菌由于能形成孢子，所以對(duì)外界有害因子的抵抗力非常強(qiáng)，在水環(huán)境中廣泛存在。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌在我國近海分布廣、數(shù)量多，且在養(yǎng)殖水體中檢出率高［33-35］，本研究的結(jié)果與其一致。另有研究如HUYS等［36］在亞洲南部地區(qū)（馬來西亞、泰國和越南）的12個(gè)養(yǎng)魚場和對(duì)蝦養(yǎng)殖場采樣，通過菌種鑒定發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌分布廣、豐度大，所占總菌比例為5．9%；GAO等［37］發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌普遍存在于我國天津水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域，而且經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)其包含多種抗性基因。結(jié)合國內(nèi)外的文獻(xiàn)支持，本研究的結(jié)果可為我國沿海水域微生物多樣性的研究提供生物信息和數(shù)據(jù)參考。